恒河猴Tetherin基因cSNP及HIV-1適應性拮抗恒河猴Tetherin抗病毒作用的研究.pdf

1、自然界中，病毒與宿主間存在協(xié)同進化的現(xiàn)象。一方面，宿主不斷進化出防御機制來抑制病毒入侵、復制等，另一方面，病毒針對宿主的防御機制也進化出獨特的機能來規(guī)避宿主對它的抑制。協(xié)同進化不僅促進了兩個相互作用物種之間的適應性，增加了生物的多樣性，同時也對病毒跨物種傳播帶來了很大阻礙。在人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的研究中發(fā)現(xiàn)，宿主細胞天然存在先天免疫因子，對病毒的侵入、復制和出芽存在限制作用。

2、這些因子被稱為“宿主限制因子”，參與先天性免疫反應，干擾病毒生命周期的不同階段，達到對病毒的限制作用。目前已發(fā)現(xiàn)的限制因子有:APOBEC3 G(apolipoprotein BmRNAediting enzyme3G)、Trim5α(tripartite motif protein5α)、Tetherin(也被稱做CD317或HM1.24)、SAMHD1(sterileα motif domain and HD domain-cont

3、ainingprotein1)。這些限制因子可有效地限制逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染，是宿主抵抗病毒感染的一個重要防御屏障。Tetherin是一種具有特殊拓撲結(jié)構(gòu)的脂筏相關跨膜蛋白，它可通過連接病毒和宿主細胞膜，將新出芽的病毒束縛在細胞膜表面，從而限制病毒釋放[。
　　在恒河猴免疫缺陷病毒(SIV)/恒河猴實驗動物模型的研究中，人們同樣發(fā)現(xiàn)了恒河猴細胞內(nèi)也存在Tetherin蛋白來抑制SIV在恒河猴體內(nèi)的擴散。而且恒河猴的Tetherin基因

4、具有一定多態(tài)性，但是對于恒河猴Tetherin基因多態(tài)性及其多態(tài)性對自身蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響并沒有明確報道。另一方面，Tetherin作為一種天然抗病毒蛋白，在不同的物種中，它的蛋白結(jié)構(gòu)也有所不同，具有物種特異性。如果能使HIV跨過恒河猴Tetherin蛋白的限制作用，這可以成為對AIDS動物模型優(yōu)化的重要一步。
　　方法:本研究通過基因測序、序列比對、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測等技術，探尋恒河猴tetherm基因位置上可能影響其蛋白功能的c

5、SNP位點，再把不同基因型的tetherin插入到真核表達載體pcDNA3.1(-)中，構(gòu)建不同基因型的tetherin表達載體。用不同基因型的tetherin表達載體與SIVmac239共轉(zhuǎn)染293T細胞，檢測轉(zhuǎn)染后SIV的病毒載量，以及流式檢測Tetherin基因在細胞表面的表達情況，最后對恒河猴進行基因型的分類，比較不同基因型SIV感染恒河猴之間的病毒復制情況。另一方面，構(gòu)建表達恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL細胞系，通過

6、HIV-1NL4-3在表達恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL與不表達恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL的混合細胞中培養(yǎng)，在體外模擬自然進化，最終使得HIV-1NL4-3能夠產(chǎn)生適應性毒株，感染表達恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL，實現(xiàn)HIV-1NL4-3對恒河猴Tetherin限制作用的跨越。
　　結(jié)果:序列比對發(fā)現(xiàn)8個非同義突變位點;用Psipred軟件預測分析，發(fā)現(xiàn)其中G41A、T128C、C129和A33

7、3C這四個cSNP位點會使Tetherin蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。在各基因型恒河猴tetherin表達載體與SIVmac239共轉(zhuǎn)染293T的試驗中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染不同tetherin表達載體的293T細胞表達SIV病毒的載量之間并無統(tǒng)計學差異。但是不同基因型恒河猴的tetherin基因轉(zhuǎn)染細胞后Tetherin蛋白表達有所不同，GLQ和GPH型的恒河猴Tetherin蛋白表達要顯著高于DLQ和DPH型。在對不同基因型恒河猴的SIVmac23

8、9后病毒復制峰值和病毒復制控制值的比較中，發(fā)現(xiàn)DLQ基因型恒河猴病毒復制水平要高于GLQ型恒河猴(p＜0.05)，其他基因型恒河猴的感染值之間沒有顯著差異。
　　成功構(gòu)建表達恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL后，通過HIVNL4-3分別在表達恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL中和不表達恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，比較兩種細胞感染之間的病毒蛋白P24濃度以及活力，發(fā)現(xiàn)不同組別之間病毒P24濃度沒有

9、統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論:在中國恒河猴的tetherin基因中，我們發(fā)現(xiàn)了9個cSNP位點，其中有四個cSNP位點(G41A、T128C、C129和A333C)可影響Tetherin蛋白的二級結(jié)構(gòu)。經(jīng)過體外細胞實驗和恒河猴體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，恒河猴Tetherin基因的cSNP并沒有影響其抗病毒作用，但卻可以影響SIV對其拮抗作用。在HIVNL4-3對表達恒河猴Tetherin的TZM-BL的適應性培養(yǎng)中，我們并沒有發(fā)現(xiàn)恒河猴Tether