養(yǎng)心通脈方對兔骨髓內(nèi)皮祖細胞數(shù)量和功能的影響.pdf

1、研究背景:冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atheroscleroticheart disease，CHD）冠脈彌漫性、多支病變無法通過PCI治療實現(xiàn)血運重建，現(xiàn)有藥物無法改善這類心肌缺血。近年發(fā)現(xiàn)在成人外周血存在內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，EPCs可歸巢到缺血心肌局部，不僅參與缺血區(qū)血管新生，而且引發(fā)血管發(fā)生，通過移植EPCs可以很好治療缺血性疾病。如何加強EPCs的動

2、員并增加其數(shù)量增強其功能是EPCs移植的關鍵。養(yǎng)心通脈方治療CHD效果顯著，推測養(yǎng)心通脈方能改善EPCs數(shù)量和功能。
　　目的:通過摸索養(yǎng)心通脈方改善體外培養(yǎng)的兔骨髓源EPCs線粒體活性干預作用的最佳藥物劑量和干預時間，并觀察養(yǎng)心通脈方在此干預條件下對EPCs的增殖、遷移和黏附功能的影響，為后續(xù)進行移植養(yǎng)心通脈方預處理的EPCs促進缺血心肌血管新生的相關實驗研究打下基礎。
　　方法:利用密度梯度離心法，從骨髓獲取單個核細胞(

3、MNC)，并用內(nèi)皮祖細胞專用培養(yǎng)體系將MNC誘導培養(yǎng)為EPCs，對細胞DIL-AC-LDL和FITC-UEA-I熒光染色鑒定，并計算雙熒光染色陽性細胞率。利用CCK-8比色法觀察養(yǎng)心通脈方含藥血清對EPCs的線粒體活力的影響，并尋找養(yǎng)心通脈方含藥血清對EPCs的線粒體活力干預作用的最佳藥物劑量和干預時間。利用CCK-8法測定EPCs的增殖能力。首先建立CCK-8與EPCs反應的標準曲線。將EPCs隨機分為治療組、對照組，各組經(jīng)預處理后酶

4、標儀測450nm下OD值;利用Transwell遷移小室法測定EPCs遷移能力。治療組和對照組細胞用培養(yǎng)液重懸計數(shù)后注入到Transwell小室上室，Transwell下室加培養(yǎng)液和VEGF(50ug/ml)。37℃、5％CO2溫箱培養(yǎng)24h，刮去濾膜上面的未移動細胞，多聚甲醛固定濾膜下面的遷移細胞，吉姆薩染色后在倒置顯微鏡下觀察計數(shù)遷移細胞;貼壁法觀察EPCs黏附能力。消化搜集各組細胞，重懸后計數(shù)，細胞懸液接種到預先用FN包被的96孔

5、板，培養(yǎng)4h后倒置顯微鏡下隨機取5個視野(×200)觀察貼壁細胞數(shù)。
　　結果:(1)EPCs的培養(yǎng)及鑒定:原代培養(yǎng)第2天細胞開始貼壁，第3天形成集落，內(nèi)有多量單個核細胞，第4天梭形細胞從集落中心向外周長出，第5天鏡形成類似胚胎時期的“血島”結構，第10天鏡見集落內(nèi)梭形細胞放射狀排列，或者細胞首尾連接成環(huán)狀結構，培養(yǎng)到第20天的細胞呈DIL-ac-LDL和FITC-UEA-I雙熒光染色陽性。(2)成功建立EPCs與CCK-8標準曲

6、線。養(yǎng)心通脈方藥物濃度為10％時改善EPCs的線粒體活力作用最顯著(P＜0.05);養(yǎng)心通脈方藥物干預時間為96h時改善EPCs的線粒體活力作用最顯著(P＜0.05);養(yǎng)心通脈方在上述干預條件下能明顯增強EPCs的增殖、遷移和黏附能力。
　　結論:一、本實驗成功掌握了在體外培養(yǎng)骨髓來源的EPCs的關鍵技術，培養(yǎng)的EPCs穩(wěn)定性強，純度高，數(shù)量大且實驗操作簡單，可重復性強。二、養(yǎng)心通脈方能提高體外培養(yǎng)的兔骨髓源EPCs的活性，且這種