小鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞增殖特征的研究.pdf

1、近年來的基礎(chǔ)和臨床研究提示內(nèi)皮祖細胞(endothelialProgenitor cells，EPCs)可以治療缺血性心臟病以及各種疾病引起的肢體缺血，也可以用于組織工程的血管構(gòu)建，或者作為基因治療的載體和腫瘤治療的新靶點等。由于內(nèi)皮祖細胞的諸多優(yōu)點及其廣泛的應(yīng)用前景，使得內(nèi)皮祖細胞成為各國學(xué)者研究的熱點。從而建立了一些分離、培養(yǎng)、鑒定的方法，并且對于內(nèi)皮祖細胞的增殖的特性也有了一些研究和了解。然而大部分的文獻是對外周血和臍帶血來源的內(nèi)

2、皮祖細胞的研究，對于骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞的培養(yǎng)、增殖特性研究甚少。 研究目的：建立優(yōu)化的小鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞的培養(yǎng)方法、研究小鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞的集落形成能力和增殖潛能以及GM-CSF對小鼠骨髓內(nèi)皮細胞的促增殖作用。 研究方法：用本實驗室配制的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(Endo-M)培養(yǎng)小鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞，通過Wright’s Giemsa、免疫熒光法觀察內(nèi)皮祖細胞的形態(tài)及表型；MTT法、劃痕實驗及不同濃度：Endo-M培養(yǎng)液對內(nèi)皮細

3、胞集落生成的影響觀察：Endo-M對內(nèi)皮細胞增殖的影響；通過內(nèi)皮細胞的傳代培養(yǎng)觀察內(nèi)皮祖細胞集落形成能力及增殖潛能；加入不同濃度的GM-CSF，通過集落形成率、MTT法和流式細胞儀檢測內(nèi)皮細胞生長周期等方法來觀察GM-CSF對小鼠骨髓內(nèi)皮細胞增殖的作用。 實驗結(jié)果：(1)內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基 (Endo-M)誘導(dǎo)的骨髓細胞可以生成內(nèi)皮細胞，vWF檢測陽性。(2)MTT實驗以及劃痕實驗結(jié)果表明Endo-M組與對照組相比，P均小于0.05

4、，有顯著性差異。說明Endo-M培養(yǎng)液對內(nèi)皮細胞的促增殖作用明顯。內(nèi)皮細胞以較低濃度種植時可形成集落，Endo-M培養(yǎng)液對內(nèi)皮細胞集落的多少沒有影響，對內(nèi)皮細胞集落的大小影響顯著。(3)骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞具有等級性，可分為四個等級：高增殖潛能內(nèi)皮集落形成細胞(HPP-ECFCs)、低增殖潛能內(nèi)皮集落形成細胞(LPP-ECFCs)、內(nèi)皮細胞叢(EndothelialCell C1uster)、成熟分化的內(nèi)皮細胞(Mature Diffe

5、rentiatedEdothelium)。HPP-ECFCs可以進行再種植和第三次種植并形成集落。內(nèi)皮細胞整體的增殖能力顯示經(jīng)過 5 次傳代，內(nèi)皮細胞增殖了516.574±71.36倍。觀察小鼠骨髓內(nèi)皮細胞不同代次的增殖能力與不同代次集落增殖的比較，顯示隨著傳代的進行，內(nèi)皮祖細胞的增殖潛能和集落形成能力是逐漸下降的。(4)加入不同濃度的GM-CSF,通過觀察集落形成率和MTT法均證實了GM-CSF對內(nèi)皮細胞的增殖具有明顯的促進作用。流式

6、細胞儀檢測結(jié)果顯示了GM-CSF處理組的細胞進入S期的比率為9.3％，對照組為2.1％，說明GM-CSF可以通過促使內(nèi)皮細胞進入S期，加快了細胞的分裂，從而促進了細胞的增殖。比較第一代和第四次傳代后細胞的生長曲線，兩者無明顯差別，說明多次傳代后的內(nèi)皮細胞仍保持傳代早期內(nèi)皮細胞的增殖潛能。 結(jié)論：1．骨髓中內(nèi)皮祖細胞具有等級性。 2．骨髓內(nèi)皮祖細胞有巨大的增殖潛能。 3．骨髓內(nèi)皮祖細胞的增殖潛能隨傳代次數(shù)的增加而逐