豬骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定的優(yōu)化方案.pdf

1、內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitorcell,EPC)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,在生理或病理因素刺激下,可從骨髓被動員到外周血進(jìn)行損傷的修復(fù)。內(nèi)皮祖細(xì)胞又稱為血管母細(xì)胞(angioblast),既參與出生后的血管生成(angiogenesis,AG),同時亦參與機(jī)體、器官損傷后的血管再生與修復(fù)。血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell,EC)是血液和周圍組織的一道屏障,光滑連續(xù)的EC層保證了血液中各種細(xì)胞在血管

2、里正常的流動,并分泌某些重要的調(diào)節(jié)因子,如-氧化氮(NitricOxide,NO)等。在正常情況下,體循環(huán)中有極少量來源于血管壁的EC,維持其正常水平的更新。而當(dāng)EC大量損傷時,則無法滿足內(nèi)皮層愈合的需要。近年來多項研究證實,來源于骨髓的EPC能在缺血或血管損傷時動員至體循環(huán)中,并募集在缺血或損傷處分化為成熟的EC,形成新生血管。大量的動物和臨床實驗都已經(jīng)證明：當(dāng)組織受到損傷時,尤其是缺血性損傷時,循環(huán)及組織中EPC動員和增殖能力增強(qiáng),

3、并可以在組織內(nèi)分化為內(nèi)皮細(xì)胞替換功能障礙的內(nèi)皮細(xì)胞、修補(bǔ)裸露的血管內(nèi)皮損傷區(qū),并參與缺血或損傷組織內(nèi)新血管生成,從而改善的功能。 近年來的研究顯示,內(nèi)皮祖細(xì)胞在心腦血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮重要作用。且臨床上通過EPC移植治療缺血性疾病獲得成功,具有廣闊的應(yīng)用前景。但是無論從骨髓、臍血、胚胎肝和外周血中分離培養(yǎng)出EPC數(shù)量都非常有限,不能滿足實驗研究及臨床應(yīng)用的需要,這是目前限制內(nèi)皮祖細(xì)胞的廣泛應(yīng)用的一個主要原

4、因。因此,探討如何培養(yǎng)擴(kuò)增出大量穩(wěn)定的內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法很有必要。本研究將根據(jù)內(nèi)皮譜系細(xì)胞的特性,參照國內(nèi)外多家實驗室的培養(yǎng)及鑒定方案,在實驗中反復(fù)摸索,得出影響EPC培養(yǎng)擴(kuò)增的主要因素,通過生長曲線及增值倍數(shù)對常用分離培養(yǎng)條件及方法進(jìn)行比較,并予鑒定及功能檢測,得出最佳方案。為移植內(nèi)皮祖細(xì)胞在治療心血管疾病及多器官功能障礙綜合癥奠定良好的基礎(chǔ)。 本實驗研究共分兩部分： 第一部分：目的：通過對國內(nèi)外常用方法的比較建立起小型

5、豬骨髓EPC的標(biāo)準(zhǔn)化分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法,為內(nèi)皮祖細(xì)胞的移植奠定基礎(chǔ)。方法：(1)利用無菌技術(shù)在豬髂骨抽取骨髓,用密度梯度離心法分離出單個核細(xì)胞,并予誘導(dǎo)分化。對不同的培養(yǎng)條件及方法進(jìn)行分組：A組(按PO接種密度)、B組(按PO換液時間)、C組(按P4代接種密度)、D組(按基礎(chǔ)培養(yǎng)液)、E組(按血清濃度)、F組(按包被液)、(按細(xì)胞因子濃度)G組(VEGF)、H組(bFGF)、Ⅰ組(EGF)、J組(IGF),培養(yǎng)擴(kuò)增出大量穩(wěn)定的內(nèi)皮祖

6、細(xì)胞；(2)對原代EPC行細(xì)胞集落個數(shù)及EPC獲得率比較,成熟后EPC通過比較細(xì)胞的生長曲線及15天增殖倍數(shù)；(3)利用SPSS統(tǒng)計軟件,對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)、分析、比較。結(jié)果：通過各種不同培養(yǎng)條件及方法得到的EPC細(xì)胞形態(tài)基本相似,但實施每組各水平細(xì)胞的生長速度及增殖情況不一。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析A、B組,不同水平間均有差異(P<0.05),以實施A②、B③方法的原代集落個數(shù)生成最多,EPC獲得率相對較高。C、D、E、F、G、I、J組中,經(jīng)統(tǒng)計

7、學(xué)分析C、D組,不同水平間均有差異(P<0.05),而E組③、④,F組②、③、④,G組④、⑤,H組③、④,Ⅰ組③、④,J組③、④無明顯差異(P>0.05),但與其他水平之間均有差異(P<0.05);以實施C組②,D組②,E組③、④,F組②、③、④,G組④、⑤,H組③、④,Ⅰ組③、④,J組③、④的培養(yǎng)的細(xì)胞生成曲線每天值均較高,生長趨勢較好,在15天內(nèi)細(xì)胞增殖倍數(shù)最多。結(jié)論：經(jīng)比較得出最佳培養(yǎng)方案：原代接種密度為1×106/cm2,原代換

8、液時間及方法為接種24h棄貼壁取懸浮細(xì)胞接種,48h、72h、96h均換液后取貼壁細(xì)胞繼續(xù)接種培養(yǎng),P4代及以后接種密度為1×104/cm2,包被液(1％明膠、2％FN、1％明膠和2％FN 1:1),最佳培養(yǎng)液為M199+10％FBS+VEGF10ng/ml+bFGF50ng/ml+IGF50ng/ml+EG20ng/ml。 第二部分目的：鑒定培養(yǎng)擴(kuò)增出的內(nèi)皮祖細(xì)胞并測定其功能,保證分離及培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞的性質(zhì)及純度。方法：(1)以

9、Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1雙色熒光染色法和用CD133、CD34、CD31、KDR等表型表達(dá)行免疫組化鑒定EPC及流式細(xì)胞儀(FACS)檢測EPC純度；(2)體外血管生成功能試驗、遷徙實驗、細(xì)胞培養(yǎng)液一氧化氮(NO)含量測定分析EPC功能。結(jié)果：(1)均行Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1雙染及免疫組化、流式細(xì)胞儀檢測CD133、CD34、CD31、KDR等的陽性率符合EPC表型特征；(2)體外血管生成功能試驗、