甘藍型油菜油質蛋白（Oleosin）cDNA的克隆和表達.pdf

1、油質蛋白(Oleosin)是一類特殊的貯藏蛋白，主要在油料植物種子中特異表達，以膜嵌入方式依附在油體表面，在油體發(fā)生和分解消失過程中起著重要生物學作用。本文以甘藍型油菜種子中油質蛋白的cDNA為研究對象，對其進行克隆和表達，用以了解油質蛋白在甘藍型油菜中時、空的表達以及與TAG積累的關系，同時為油質蛋白(Oleosin)在植物基因工程中利用提供分子生物學基礎。 1.本文利用熱CTAB-LiCl聯(lián)用法從油菜種子中提取RNA，所得到

2、的RNA樣品經紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳分析證明具有較高的純度和完整性，并克服了油脂、多糖及次生代謝物質等的干擾。 2.RT-PCR法從種子中擴增Oleosin的cDNA片段和Perilipin、SREBP的cDNA片段。電泳結果表明：在植物種子中沒有擴增到動物脂肪周邊蛋白的cDNA片斷，而動物中控制脂肪代謝過程中合成酶的轉錄因子有條帶，說明動植物在脂肪合成上有相同的脂肪合成代謝調控。測序結果表明：甘藍型和白菜型油菜種子中的

3、Oleosin的cDNA序列分別是275bp、281bp，同源性為91％。通過5’RACE對油質蛋白的cDNA進行全長擴增，并進行Blast比對：484bp片段與擬南芥4號染色體A6(1989bp)的beta-1，3glucanasehomologue同源性高。 3.利用擴增油質蛋白的cDNA片段作探針，對不同時期和含油量不同油菜種子中的mRNA進行Northernblotting，結果表明不同含油量的種子中，mRNA在表達上的

4、差異不明顯，說明與含油量即TAG的積累沒有直接的關系。 4.重新設計一個單引物與5’RACE的巢式引物擴增甘藍型與白菜型種子中油質蛋白讀碼框的cDNA，與pMD18-T載體連接克隆、測序，甘藍型與白菜型種子中讀碼框的cDNA同源性為99％，連接上面擴增的白菜型種子中的油質蛋白的cDNA片段，對白菜型的Oleosin-like-protein接近全長的cDNA進行基因注冊。 5.構建油質蛋白讀碼框cDNA與pTYB2的表達