應(yīng)用基因芯片篩選胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及生物信息學(xué)研究.pdf

1、研究背景:胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在各類惡性腫瘤中居第二位,死亡率居各類惡性腫瘤之首.早期胃癌預(yù)后較好,而進展期胃癌預(yù)后很差,5年生存率僅為10﹪～30﹪.胃癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其預(yù)后差的根本原因,腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的重要途徑,約占術(shù)后胃癌復(fù)發(fā)的50﹪左右,是胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)并導(dǎo)致死亡的最常見原因.因此研究胃癌轉(zhuǎn)移的分子機制對于腫瘤患者的診斷和治療具有十分重要的意義.腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移受多種因素調(diào)控,是多種生物分子和信號通路相互作用的

2、復(fù)雜的生物學(xué)過程.傳統(tǒng)的研究方法一次只能檢測一個或幾個基因,很難詮釋腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的全過程.基因芯片是檢測腫瘤基因差異表達譜最有效的技術(shù)之一,它對于探討胃癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移的分子機制,尋找胃癌早期診斷、預(yù)后判斷的分子標記物和基因治療靶點具有非常重要的意義. 目的：本研究采用基因表達譜芯片比較癌旁非腫瘤胃粘膜、胃癌原發(fā)灶和胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶的基因表達譜,旨在篩選與胃癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,為進一步闡明胃癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移

3、的分子機制,尋找胃癌早期診斷、預(yù)后判斷的分子標記物和基因治療靶點奠定了理論基礎(chǔ). 方法：應(yīng)用TRIzol分別提取非腫瘤胃粘膜(A組)、胃癌原發(fā)灶(B組)和胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶(D組)組織的總RNA,用HPLC純化T7-(d7)24 primer反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA,經(jīng)Phase Lock Gel(PLG)-酚氯仿純化后,以三種組織的cDNA為模板,應(yīng)用Affymetrix公司的BioArray High Yield RNA Tran

4、script Labeling kit進行體外反轉(zhuǎn)錄,同時進行生物素標記,合成生物素化的cRNA探針.合成好的cRNA探針質(zhì)控合格后經(jīng)片段化處理(大小約50-200bp之間),分別在Affymetrix公司的專用設(shè)備Affymetrix RHybridization Oven 640中與AffymetrixGenechipRHG-U133A2.0(包括22,277個轉(zhuǎn)錄本,對應(yīng)于約20,247個人己知基因和1475個EST)雜交16小時

5、,雜交后的芯片經(jīng)過洗脫、染色處理,使用AffymetrixRScarmer3000 7G對雜交信號進行掃描,芯片掃描后獲得的數(shù)據(jù)利用AffymetrixRGCOS software進行計算處理.在比較兩組芯片的結(jié)果之前,先對每張芯片的數(shù)據(jù)進行歸一化處理.以Signal Log Ratio≥1.0或≤-1.0(表明轉(zhuǎn)錄本的水平至少提高或降低2倍)和Change p-value(代表了兩張不同芯片之間一個探針對表達水平相同或不同的可能性)≤

6、0.05(表明比較的結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義)作為篩選差異表達基因的標準,并用生物信息學(xué)對檢測結(jié)果進行分析.為確保芯片檢測質(zhì)量,Affymetrix基因芯片內(nèi)還設(shè)有GAPDH等看家基因作為對照,以及BIOB、BlOC、BIOD和CRE等外加的陽性對照以檢測基因芯片的質(zhì)量.應(yīng)用實時熒光定量PCR(Real time-PCR)定量檢測4個基因(COL1A2、SPPl、MUCl和TFF3)在三種組織的表達情況,以驗證基因芯片的檢測結(jié)果. 結(jié)果

7、：基因芯片檢測報告表明,這三張芯片的背景值和噪音值都很均勻,其中管家基因GAPDH的5'端和3'端的信號比值分別是1.26、1.05和1.17,均顯著低于標準值3.0;外加的陽性對照BIOB、BIOC、BIOD和CRE也被檢測到,并且信號強度隨著濃度由低到高呈現(xiàn)由弱到強的趨勢,表明芯片質(zhì)量良好,雜交及檢測體系正常,芯片檢測結(jié)果真實可信.利用Affymetrix公司的GCOS分析軟件對三組樣品的芯片檢測結(jié)果進行分析,并根據(jù)篩選標準篩選差異

8、表達基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實驗中胃癌原發(fā)灶組(與癌旁非腫瘤胃粘膜相比)表達上調(diào)≥2倍的有434個基因和169個EST,表達上調(diào)≥4倍的有54個基因和18個EST,表達下調(diào)≥2倍的有589個基因和369個EST,表達下調(diào)≥4倍的有90個基因和43個EST;胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶(與癌旁非腫瘤胃粘膜相比)表達上調(diào)≥2倍的有432個基因和196個EST,表達上調(diào)94倍的有65個基因和34個EST,表達下調(diào)≥2倍的有505個基因和324個EST,表達下調(diào)>t

9、4倍的有95個基因和56個EST.胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶比原發(fā)灶表達上調(diào)≥2倍的有802個基因和454個EST,表達上調(diào)≥4倍的有93個基因和39個EST,表達下調(diào)≥2倍的有個896基因和398個EST,表達下調(diào)≥4倍的有73個基因和28個EST.本文只列出了各組差異表達基因最顯著的前40個基因.根據(jù)GO(Gene Ontology)分類和聚類分析,按照其參與的生物學(xué)過程(Biological:Process)和分子功能(Molecular F

10、unction),進行了初步的功能分類.在這些差異基因中,胃癌原發(fā)灶組織高表達基因功能主要集中在細胞凋亡、代謝、細胞周期、信號傳導(dǎo)活性、轉(zhuǎn)運體活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、酶調(diào)節(jié)活性和結(jié)構(gòu)分子活性等方面,胃癌原發(fā)灶組織低表達基因功能主要集中在細胞凋亡、代謝、細胞周期、信號傳導(dǎo)活性、轉(zhuǎn)運體活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)分子活性等方面.胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶比原發(fā)灶表達上調(diào)的基因功能主要集中在細胞凋亡、代謝、細胞周期、信號傳導(dǎo)活性、結(jié)構(gòu)分子活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

11、和轉(zhuǎn)運體活性等方面,胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶比原發(fā)灶表達下調(diào)的基因功能主要集中在細胞凋亡、結(jié)合、代謝、細胞周期、酶調(diào)節(jié)活性、信號傳導(dǎo)活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運體活性等方面.同時我們通過生物信息學(xué)相關(guān)分析軟件(隊列試驗的基因表達譜分析、基于Gene Ontology分類的集群分析和Pathway分析)對實驗數(shù)據(jù)進行挖掘,結(jié)果顯示A、B、D組連續(xù)下調(diào)基因的表達變化趨勢具有顯著性(P<0.05),A、B、D組連續(xù)上調(diào)基因的表達變化趨勢具有顯著性(P<0.05

12、).在Apoptosis pathway中IRF3在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶組織高表達,IRF2在胃癌原發(fā)灶低表達,PRFl和BIRC3在胃癌原發(fā)灶和腹膜轉(zhuǎn)移灶均低表達,TRAF2在胃癌原發(fā)灶和腹膜轉(zhuǎn)移灶均高表達.在Integrin-mediated_cell_adhesion pathway中HRAS和ITGA3在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶組織高表達,CAPN1在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶組織低表達,VASP在胃癌原發(fā)灶低表達,SORBS1、RAC2和ITGA4在胃癌

13、原發(fā)灶和腹膜轉(zhuǎn)移灶均低表達.這些基因的異常表達提示這些基因可能在胃癌形成和浸潤轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用. 結(jié)論： 1.基因芯片是一個高效、快速的篩選胃癌及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的方法. 2.胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶(與胃癌原發(fā)灶比)表達上調(diào)的基因功能主要集中在細胞凋亡、代謝、細胞周期、信號傳導(dǎo)活性、結(jié)構(gòu)分子活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運體活性等方面,胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶(與胃癌原發(fā)灶比)表達下調(diào)的基因功能主要集中在細胞凋亡、結(jié)合、代謝、細胞周期