基于生物信息學(xué)技術(shù)篩選慢性乙型肝炎血液相關(guān)基因的研究.pdf

1、慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的一種世界性疾病，最初被稱作血清性肝炎。在亞非等發(fā)展中國家發(fā)病率高，是中國的地方病。全世界約三分之一人一生中都曾一度感染過慢性乙型肝炎，其中無癥狀乙肝病毒攜帶者(HBsAg攜帶者)超過3.5億，我國約占1.3億。多數(shù)無癥狀，其中1/3出現(xiàn)肝損害的臨床表現(xiàn)。目前我國有乙肝患者3000萬。乙肝的特點(diǎn)為起病較緩，以亞臨床型及慢性型較常見。無黃疸型HBsAg持續(xù)陽性者易慢性化。本病主要通過血液、母嬰和性接觸進(jìn)行傳

2、播?！奥愿窝住卫w維化→肝硬化→肝癌”是肝臟疾病演化的一條途徑，對病患的生存形成相當(dāng)大的威脅。乙肝所致的慢性肝炎在各種病因所致的慢性肝炎中約占80％～90％。慢性肝炎持續(xù)時(shí)間可長達(dá)數(shù)年，甚至數(shù)十年。本病通常表現(xiàn)較輕，不產(chǎn)生任何癥狀或明顯的肝損害，但有些病例，持續(xù)的炎癥會(huì)緩慢地?fù)p傷肝臟，最終導(dǎo)致肝硬化和肝癌，而肝癌患者預(yù)后極差，治療方法較少。目前，乙肝疫苗的應(yīng)用是預(yù)防和控制乙型肝炎的主要措施，雖全面接種乙肝疫苗可以使乙肝患病率大幅度下降

3、，但由于我國乙肝感染患者基數(shù)龐大，新的乙肝患者還在不斷出現(xiàn)，且在經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展不如我們的國家，乙肝還在繼續(xù)蔓延。因此，尋找有效治療乙肝的方法是醫(yī)務(wù)人員和科研工作者急需解決的難題。
　　 基因芯片作為21世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要的技術(shù)平臺(tái)，是篩選差異表達(dá)相關(guān)基因的有效手段，具有高通量和快速測量等優(yōu)點(diǎn)。基因表達(dá)譜是指通過構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細(xì)胞或組織的非偏性cDNA文庫，大規(guī)模cDNA測序，收集cDNA序列片段、定性、定量分析

4、其mRNA群體組成，從而描繪該特定細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)種類和豐度信息，這樣編制成的數(shù)據(jù)表就稱為基因表達(dá)譜。由于表達(dá)譜芯片在研究細(xì)胞基因表達(dá)模式上具有的優(yōu)勢，利用它可獲取腫瘤細(xì)胞生長的各期以及腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中相關(guān)基因的表達(dá)模式變化，因此，基因表達(dá)譜芯片已廣泛應(yīng)用于腫瘤發(fā)生機(jī)制、早期診斷、腫瘤基因分型、指導(dǎo)治療及評估預(yù)后等研究領(lǐng)域。隨著表達(dá)譜芯片技術(shù)的廣泛開展，產(chǎn)生了豐富的、海量的、復(fù)雜的生物信息數(shù)據(jù)。如何解讀芯片上成千上萬

5、個(gè)基因點(diǎn)的雜交信息，揭示其中蘊(yùn)含的生命特征和規(guī)律，己成為限制基因芯片技術(shù)應(yīng)用和發(fā)展的主要“瓶頸”。
　　 生物信息學(xué)是現(xiàn)代生物學(xué)與醫(yī)學(xué)科學(xué)（如生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、基因組學(xué)、生理學(xué)）和信息科學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、生物統(tǒng)計(jì)學(xué)、數(shù)學(xué)等學(xué)科相互滲透并高度交叉形成的一門新興前沿學(xué)科，最初常被稱為基因組信息學(xué)，它以生物芯片研究為基礎(chǔ)，以獲取、加工、儲(chǔ)存、管理、檢索、分配、分析和釋讀生物學(xué)實(shí)驗(yàn)信息為手段，綜合運(yùn)用數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科

6、學(xué)和生物學(xué)工具，以達(dá)到理解數(shù)據(jù)中所蘊(yùn)含的生物學(xué)含義的目的。由于目前研究對象主要集中于核苷酸和氨基酸兩方面，所以，狹義地說，生物信息學(xué)就是將計(jì)算機(jī)科學(xué)和數(shù)學(xué)應(yīng)用于生物大分子信息的獲取、加工、存儲(chǔ)、分類、檢索與分析，以達(dá)到理解這些生物大分子信息的生物學(xué)意義的交叉學(xué)科。
　　 生物信息學(xué)的主要研究內(nèi)容包括生物分子數(shù)據(jù)的收集與管理、數(shù)據(jù)庫搜索與序列比較、基因組序列信息分析、基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析與處理、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測、系統(tǒng)發(fā)生分析、比較基因

7、組學(xué)等方面。具體地說，生物信息學(xué)的研究范圍包括以下幾個(gè)方面:①基因組相關(guān)信息的獲取、儲(chǔ)存、管理、處理、分配與解釋。②新基因的發(fā)現(xiàn)與定位、功能注釋、調(diào)控機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)關(guān)系等研究。③非編碼區(qū)信息結(jié)構(gòu)分析。④生物進(jìn)化的研究。⑤完整基因組的比較研究。⑥基因組信息分析的方法研究。⑦功能基因組相關(guān)信息分析，包括與大規(guī)模基因表達(dá)譜分析相關(guān)的算法、軟件研究，基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究等。⑧蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測、模擬和分子設(shè)計(jì)。⑨藥物設(shè)計(jì)以及應(yīng)用發(fā)展研究等。

8、
　　 生物信息學(xué)是當(dāng)今生命科學(xué)和自然科學(xué)的重大前沿領(lǐng)域之一，同時(shí)也是21世紀(jì)自然科學(xué)的核心領(lǐng)域之一，其研究重點(diǎn)主要體現(xiàn)在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)兩方面。目前基因組學(xué)的研究出現(xiàn)了幾個(gè)重心的轉(zhuǎn)移:一是將已知基因的序列與功能聯(lián)系在一起的功能基因組學(xué)研究。二是從作圖為基礎(chǔ)的基因分離轉(zhuǎn)向以序列為基礎(chǔ)的基因分離。三是從研究疾病的起因轉(zhuǎn)向探索發(fā)病機(jī)理。四是從疾病診斷轉(zhuǎn)向疾病易感性研究。其中，功能基因組學(xué)隨著人類基因組計(jì)劃繪圖與測序工作（即結(jié)構(gòu)基

9、因組學(xué)）的完成已成為新的研究熱點(diǎn)。在腫瘤研究中，目前常用的分析方法包括序列比對、統(tǒng)計(jì)分析、可視化作圖、生物聚類、通路分析及啟動(dòng)子預(yù)測等。在分子水平進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘、對疾病進(jìn)行闡述，為腫瘤分子發(fā)病機(jī)理的研究開闊了新的研究思路，從而更加全面地從整體上對疾病進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要集中在以下方面:(1)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。(2)基于基因組上下文預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用，如基因鄰居（gene“neighbor”）、系統(tǒng)發(fā)生譜(phylogeneti

10、c profiles)和基因融合(Rosetta stone method)方法。(3)利用生物信息學(xué)對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行理論模擬與結(jié)構(gòu)預(yù)測，從而為藥物分子設(shè)計(jì)提供依據(jù)。
　　 本研究內(nèi)容主要分為以下三個(gè)部分:
　　 第一部分:慢性乙型肝炎基因表達(dá)譜芯片研究。收集慢性乙型肝炎患者及未患病志愿者血液標(biāo)本各三例，采用美國Affymetrix公司的Human Genome U133Plus2.0 Array基因表達(dá)譜芯片，按一步法

11、抽提慢性乙型肝炎患者及志愿者血液白細(xì)胞總RNA，分離純化，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成摻入生物素標(biāo)記的cDNA合成探針，與芯片雜交和嚴(yán)格洗片后，用熒光掃描儀掃描芯片熒光信號圖像，分析慢性乙型肝炎患者與正常人巾差異表達(dá)的基因。掃描儀結(jié)果經(jīng)仔細(xì)分析后，發(fā)現(xiàn)有37542條基因被檢出。經(jīng)檢驗(yàn)，芯片結(jié)果準(zhǔn)確有效，可用于進(jìn)一步分析利用。
　　 第二部分:慢性乙型肝炎發(fā)病相關(guān)基因的篩選。本研究利用基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件BRB-ArrayTools4.2.1，對

12、第一部分獲得的慢性乙型肝炎基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討基于基因表達(dá)譜的途徑篩選腫瘤發(fā)病相關(guān)基因。首先將芯片數(shù)據(jù)導(dǎo)入BRB-ArrayTools4.2.1，進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選，然后通過層次聚類，分組分析找出差異表達(dá)基因，進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析。結(jié)果得到51個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)31個(gè)，下調(diào)20個(gè)。經(jīng)功能注釋后通路分析發(fā)現(xiàn)，它們主要被富集到四個(gè)生物通路中:白介素信號通路，炎癥趨化因子和細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路，凋

13、亡信號通路以及FAS信號通路。
　　 第三部分:慢乙肝發(fā)病相關(guān)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。對于芯片數(shù)據(jù)，獲得差異表達(dá)基因僅是第一步，但這些差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系及所表達(dá)的蛋白質(zhì)間的相互作用并不能從基因表達(dá)譜中分析到，更重要的是如何對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行恰如其分的注釋，以揭示這些基因在特定條件下的相互關(guān)系。本章利用GATHER、STRING、Cytoscape等方法對差異基因進(jìn)行生物學(xué)分析和相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上

14、調(diào)基因主要被富集到細(xì)胞黏附、Wnt信號通路、內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)展等通路中。而下調(diào)基因剛多被富集到機(jī)體免疫應(yīng)答，防御反射，對生物刺激等各種體內(nèi)外刺激的應(yīng)答等生物學(xué)功能。為進(jìn)一步了解差異基因間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，用STRING在線工具對51個(gè)慢性乙型肝炎相關(guān)差異基因編碼的蛋白質(zhì)間的相互作用進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的蛋白間的相互作用主要集中在11個(gè)蛋白。通過Cytoscape構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因中六個(gè)編碼蛋白質(zhì)與這

15、些差異基因有密切聯(lián)系，它們是:FLNC，MDK，TK1，THBS1，MAPK12和CD93。其中，MDK，TK1等基因與STRING分析結(jié)果一致，再次證明了它們的重要性。
　　 綜上所述，本研究在芯片實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法有效地分析了慢性乙型肝炎發(fā)病的基因芯片數(shù)據(jù)，運(yùn)用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析工具、生物信息學(xué)工具及文獻(xiàn)挖掘工具對慢性乙型肝炎有關(guān)差異基因進(jìn)行了深入的生物信息學(xué)分析，成功篩選到11個(gè)慢性乙型肝炎異常表達(dá)的結(jié)點(diǎn)基因，