水稻中OsGLP1的生化特性和生理功能分析.pdf

1、類萌發(fā)素蛋白（Germin-like proteins，GLPs）是與germin相似性達(dá)到30％到70%的蛋白。已有的報(bào)道表明該蛋白廣泛存在于被子植物中，參與植物許多重要的生理過程，但關(guān)于其確切的生化和生理功能卻知之甚少。為進(jìn)一步探討OsGLP1的生理功能及其作用的分子機(jī)制，本論文首先構(gòu)建了過表達(dá) OsGLP1/OsGLP1-His的水稻植株及CRISPR/Cas9定點(diǎn)編輯的OsGLP1植株，然后分析了轉(zhuǎn)基因植株表型及相關(guān)生理指標(biāo)的變

2、化，所得結(jié)果如下：
　　（1）過量表達(dá)OsGLP1/OsGLP1-His水稻轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建
　　以水稻粳稻品種DongJing基因組的DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，分別構(gòu)建重組載體pOx-OsGLP1和一個(gè)帶His蛋白純化標(biāo)簽的重組載體pOx-OsGLP1-His。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將上述兩個(gè)載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織，成功獲得過量表達(dá) OsGLP1的株系？個(gè)及過量表達(dá)OsGLP1-His的轉(zhuǎn)基因株系3個(gè)。Western

3、blotting分析表明轉(zhuǎn)基因植株中的OsGLP1蛋白明顯提高。
　　（2）利用CRISPR/Cas9定點(diǎn)編輯技術(shù)構(gòu)建OsGLP1突變的水稻轉(zhuǎn)基因植株
　　采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pYLCRISPR/Cas9-OsGLP1載體成功轉(zhuǎn)入DJ中，經(jīng)潮霉素篩選獲得10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。T0代植株測(cè)序結(jié)果顯示10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中的OsGLP1均有突變，其中大多數(shù)植株為嵌合體和復(fù)等位突變，少數(shù)為雜合子和純合子。在 T1代，篩選到3個(gè)不含外源基因但

4、OsGLP1已成功突變的轉(zhuǎn)基因株系。
　?。?）OsGLP1是一個(gè)熱穩(wěn)定性很高但不具有SOD活性的蛋白
　　過量表達(dá)OsGLP1水稻植株葉片中的SOD活性并未提高，而OsGLP1突變植株葉片中的SOD活性反而升高。將過量表達(dá)OsGLP1水稻植株葉片蛋白粗提液在70℃加熱60 min，或在85℃加熱10 min，用Western bloting在上述上清液中仍可檢測(cè)到OsGLP1，說明OsGLP1的熱穩(wěn)定性較高。將過量表達(dá)Os

5、GLP1水稻植株和野生型植株DJ葉片中的蛋白粗提液在80℃加熱10 min離心，取上清超濾濃縮后在Native-PAGE中分離，采用 CBB染色法可觀察到其比 DJ明顯多一條帶，回收此帶經(jīng) SDS-PAGE分離，Western bloting檢測(cè)雜到目的條帶。但不管是采用比色法還是Native-PAGE膠上原位染色法，過量表達(dá)植株和野生型植株葉片中的SOD活性均無明顯差異，因此水稻中的OsGLP1沒有SOD活性。
　?。?）OsG

6、LP1突變導(dǎo)致水稻株高和分蘗數(shù)下降，葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)
　　與野生型相比，Cas9-OsGLP1轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出矮化、分蘗數(shù)減少、葉片出現(xiàn)棕褐色斑點(diǎn)的表型。DAB或NBT染色顯示Cas9-OsGLP1轉(zhuǎn)基因植株葉片中的H2O2和O2.-含量較野生型DJ和過表達(dá)OsGLP1水稻轉(zhuǎn)基因植株低。MV處理顯示Cas9-OsGLP1轉(zhuǎn)基因植株較野生型DJ和過表達(dá)OsGLP1水稻轉(zhuǎn)基因植株抗氧化脅迫能力更強(qiáng)。因此Cas9-OsGLP1轉(zhuǎn)基因植株