水稻OsSIZ1和OsAPX2基因的克隆和功能分析.pdf

1、本論文的研究內(nèi)容主要包括兩個部分： 1)水稻T-DNA插入突變體siz1的分析和OsSIZ1基因的功能研究； 2)水稻抗壞血酸過氧化物酶OsAPX2的克隆和功能分析。 水稻是世界上重要的糧食作物之一，又是研究單子葉植物和禾本科植物的模式植物。水稻基因組測序工作圓滿結(jié)束后，研究的主要任務(wù)就是解讀基因組。突變體尤其是標簽突變體無疑是研究基因功能的好材料，目前通過世界上很多國家科學(xué)家的努力已經(jīng)建成了有相當(dāng)規(guī)模的水稻突變

2、體庫，充分利用這些突變體資源來挖掘和鑒定基因的功能是當(dāng)前很多研究人員在從事的工作，我們實驗室也在這方面做了一些工作，并得到了一些有意義的結(jié)果。在對本實驗室創(chuàng)制的水稻增強子捕獲突變體庫研究的過程中，我們從中選取了突變表型和T-DNA標簽共分離的兩個突變體進行基因功能的研究， 主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.水稻突變體siz1在MS培養(yǎng)基上生長一周后發(fā)現(xiàn)突變體的側(cè)根與對照日本晴相比側(cè)根稠密，該表型與T-DNA插入共分離，側(cè)翼序

3、列的分析表明T-DNAA正向插入在水稻第5染色體上的基因OSJNBb0079L11.3的第三內(nèi)含子，與擬南芥的SUMOE3連接酶AtSIZ1在核苷酸序列的相似性達51.63％。Southernblot結(jié)果表明突變體中僅有一個拷貝的T-DNA插入，且無Tos17新的轉(zhuǎn)座位點出現(xiàn)。對雜合突變植株后代的GUS染色結(jié)果表明該基因符合孟德爾規(guī)律，說明該基因為單基因。OsSIZ1基因的啟動子驅(qū)動GUS基因在根、莖、葉、花和花粉等組織中表達，在花和根

4、中的染色較其它組織更深，說明該基因在花和根中強烈表達。35S啟動子驅(qū)動下的OsSIZ1和GFP融合表達載體的轉(zhuǎn)基因煙草幼苗在激光共聚焦顯微鏡下觀察，根細胞的細胞核和細胞外周發(fā)出強烈的綠色熒光。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)與日本晴相比，該突變體幼苗的地上部生長素含量低于日本晴，而根中生長素含量高于日本晴，外源生長激素IAA對突變體的主根和冠根有明顯抑制作用。從野生型植株中獲得該基因的全長cDNA發(fā)現(xiàn)有兩種轉(zhuǎn)錄本，將兩種轉(zhuǎn)錄本分別構(gòu)建功能互補載體導(dǎo)

5、入突變體中，將T0代轉(zhuǎn)基因植株的后代T1種子用來鑒定根系表型恢復(fù)情況，發(fā)現(xiàn)在帶有較長的轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)基因株系中有一個株系的根系發(fā)生表型分離，既有野生型也有突變型，這一結(jié)果與預(yù)期表型一致，說明通過引入野生型基因可以恢復(fù)突變表型，功能互補實驗成功。同時為了比較該基因與擬南芥中的同源基因的差異，我們還把OsSIZ1基因?qū)霐M南芥同源突變體siz1中，OsSIZ1基因的引入可以使植株矮小、長勢弱的突變體的表型恢復(fù)到接近野生型植株，擬南芥功能互補實驗

6、結(jié)果初步證明了OsSIZ1基因與擬南芥中的同源基因AtSIZ1基因在功能上有相似之處。本研究結(jié)果為深入研究SUMO化在水稻生長發(fā)育過程中扮演的角色提供了有用的線索，同時也為研究單子葉與雙子葉植物中SUMO化的異同提供了參考。 2.水稻矮桿不育突變體apx2中T-DNA插在OsAPX2的第四內(nèi)含子，OsAPX2基因的表達完全被抑制后，導(dǎo)致水稻花藥生長畸形，花粉活力嚴重下降，植株不能結(jié)實。apx2突變體的側(cè)翼序列擴增也僅擴增到一個T

7、-DNA插入而沒有Tos17的新位點，矮桿不育性狀與T-DNA插入共分離，這些結(jié)果意味著該基因的突變可能是導(dǎo)致突變表型的原因，因此我們進行了功能互補實驗。將OsAPX2基因?qū)爰兒贤蛔凅w后，T0代再生植株可以結(jié)實，植株高度恢復(fù)到接近野生型水稻的高度。OsAPX2基因的啟動子驅(qū)動GUS基因在根、葉、莖節(jié)、葉舌、花和花藥表達，說明抗壞血酸過氧化物酶APX2在水稻中廣泛存在。OsAPX2基因和GFP融合表達后在轉(zhuǎn)基因煙草根細胞的細胞質(zhì)和細胞外

8、周發(fā)出可見綠色熒光。對突變體、互補轉(zhuǎn)基因植株和過量表達植株葉片進行組織化學(xué)染色(DAB和NBT)，發(fā)現(xiàn)突變體中活性氧含量高于對照，而互補轉(zhuǎn)基因植株中的活性氧含量與野生型一致，說明OsAPX2基因的突變導(dǎo)致水稻葉片活性氧含量升高，尤其是H2O2的含量升高。 研究還發(fā)現(xiàn)植株體內(nèi)過量表達OsAPX2并不能提高植物清除活性氧的能力，相反會造成脅迫，說明植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除存在一個動態(tài)的、精妙的平衡，不容打破。 研究結(jié)果表明