水稻葉綠體SOD的功能分析.pdf

1、水稻（OryzasativaL.）是我國重要的糧食作物，在保障國家糧食安全中起到重要作用。由于近年極端氣候頻發(fā)（日益嚴重的頻繁干旱、極端溫度），水稻受到非生物脅迫因素的影響加劇，加之人口增長和生態(tài)環(huán)境的壓力，傳統(tǒng)的水稻育種方法難以滿足品種改良的需求。因此，通過現(xiàn)代生物學技術(shù)提高水稻對非生物脅迫的抗性是保證糧食安全的重要途徑。作物在遭受各種非生物脅迫時都會大量產(chǎn)生活性氧，由此受到次級的氧化脅迫傷害，不及時被清除將直接損傷細胞、抑制生長。S

2、OD是抵御氧化傷害的第一道防線，直接決定了脅迫下活性氧的清除效率，在作物抗性分子改良的研究中受到廣泛關(guān)注。目前已有很多利用超表達SOD基因提高植物應(yīng)對冷、熱、鹽、旱、氧化脅迫抗性的成功范例。而葉綠體是植物有氧代謝最為旺盛的細胞器，也是體內(nèi)活性氧O2-·的主要來源。葉綠體O2-·可能同時具有損傷破壞和信號傳遞的雙重作用，因此快速精確的調(diào)節(jié)葉綠體內(nèi)O2-·濃度對合理的逆境響應(yīng)起至關(guān)重要的作用。故研究水稻葉綠體SOD的功能，探索SOD對水稻葉

3、綠體內(nèi)活性氧清除和信號傳遞的控制模式，闡明SOD的分子機制，能夠為抗逆水稻的分子改良提供理論參考。
　　 本研究以水稻日本晴為材料，克隆了水稻中的7種SOD(OsFSD1,OsFSD2,OsCSD1,OsCSD2,OsCSD3,OsCSD4,OsMSD1、)全長cDNA序列，運用水稻葉肉細胞原生質(zhì)體瞬時表達的方法對7種SOD進行亞細胞定位，并對定位于水稻葉綠體的SOD進行生化分析和超表達實驗，還通過對OsFSDs的突變體分析和干

4、涉實驗進行功能驗證進而探索OsFSDs的分子作用機理。具體研究結(jié)果如下:
　　 1、從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫搜索到水稻的SOD基因序列(LOC_Os07g46990,LOC_Os03g22810,LOC_Os03g11960,LOC_Os08g44770,LOC_Os06g05110，LOC_Os06g02500，LOC_Os05g25850)，設(shè)計各自的特異性引物，以水稻總c

5、DNA為模板用高保真酶KOD進行PCR擴增，獲得預期大小的片段，連接到PEASY-T載體上，將菌落PCR正確的克隆測序，并進行BLAST比對。其中OsFSD2尚未見克隆的報道，因此我們首次克隆了一個水稻鐵型SOD的基因。
　　 2、利用已克隆的基因經(jīng)亞克隆連至改造的PUC18載體的閱讀框中，并將SOD融合于GFP的5'端，整個編碼框由35S的啟動子驅(qū)動。將上述載體通過PEG4000介導的方法轉(zhuǎn)入水稻葉肉細胞的原生質(zhì)體中來探索水稻

6、各SOD的亞細胞定位。根據(jù)共聚焦顯微鏡觀察到的結(jié)果推測:OsCSD1、OsCSD2、OsCSD3可能定位于細胞質(zhì)中，而OsCSD4、OsFSD1、OsFSD2可能定位于葉綠體中，OsMSD1可能定位于線粒體中。其中OsFSD2可能是均勻分布在葉綠體中，而OsFSD1則呈點狀分布，根據(jù)擬南芥中FSDs的定位情況同時考慮水稻OsFSD1的進化關(guān)系，我們推測OsFSD1可能定位于葉綠體的類核中。
　　 3、通常SOD是以復合體的形式在

7、植物體中發(fā)揮生理功能，因此本實驗用酵母雙雜交和GST-pull-down兩種方法進行體外驗證，初步確定在葉綠體中的三種SOD的相互作用關(guān)系。同時采用雙分子熒光互補實驗(BWC)在體內(nèi)驗證三者之間的相互作用關(guān)系。實驗結(jié)果指出:OsFSD1自身可以發(fā)生相互作用，OsFSD1和OsFSD2可以發(fā)生相互作用，OsFSD2自身不能發(fā)生相互作用，OsCSD4沒有觀察到與其他蛋白的相互作用。BIFC實驗顯示OsFSD1和OsFSD2發(fā)生相互作用產(chǎn)生的

8、黃色熒光在葉綠體中呈點狀分布，與OsFSD1的亞細胞定位結(jié)果很接近，我們推測發(fā)生相互作用的部位是葉綠體的類核。
　　 4、本實驗為了探索發(fā)生相互作用蛋白所具有的酶活性，用活性膠和“超氧化物歧化酶檢測試劑盒-WST法”兩種方法測定OsFSDs在體外的活性。結(jié)果表明:在體外OsFSD1具有酶活性，并且隨著其蛋白量的增加，其活性也在增加;在體外OsFSD2沒有酶活性。如果實驗前先將OsFSD1和OsFSD2等量4℃結(jié)合孵育，發(fā)現(xiàn)孵育后

9、的混合蛋白的酶活性比等量的OsFSD1的酶活性有明顯的增強。我們推測:植物遭受突發(fā)的逆境脅迫時，OsFSD1的表達量不可能瞬間劇增，但是它可以招募葉綠體的OsFSD2進入類核，進而形成異源二聚體來迅速提高其生物活性來響應(yīng)逆境脅迫。
　　 5、為了研究定位于水稻葉綠體中的三種SOD的功能，本實驗構(gòu)建了超表達載體和RNAi載體進行水稻遺傳轉(zhuǎn)化實驗，并對從RISDDB(RiceT-DNAinsertionsequencedatabas

10、e)突變體庫中得到的兩種鐵型SOD的突變體進行鑒定實驗。結(jié)合甲基紫精（Methylviologen，MV，造成光合系統(tǒng)Ⅱ的O2-·積累）處理超表達載體的T2代幼苗（測量被處理葉片的FV/FM值）的實驗，結(jié)果表明:超表達OsFSD2植株的抗氧化脅迫能力是三者中最強的;超表達OsFSD1次之;而超表達OsCSD4最差。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)OsCSD4在植物體中不可能出現(xiàn)高倍數(shù)的超表達，因此其抗氧化脅迫能力最差。但是三者都比對照組日本晴的抗氧化脅迫能