抗人腦膠質(zhì)瘤IgY抗體的制備及其特性分析.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:腦膠質(zhì)瘤是最常見并且多發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤。傳統(tǒng)的手術(shù)、化療和放療等手段的療效均不是很理想<'[1]>。膠質(zhì)瘤細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究表明,由于腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng),有相當(dāng)一部分腫瘤處于暫時(shí)靜息狀態(tài),即使切除了99﹪的腫瘤組織,8周后就可增殖恢復(fù)到原來(lái)的大小。隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)及生物工程技術(shù)的發(fā)展,給腦膠質(zhì)瘤的治療帶來(lái)了新的希望。其中抗體介導(dǎo)的免疫診斷治療已成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)之一<'[2]>。 所謂IgY抗體就是一種從卵

2、黃中提取的具有特殊生物學(xué)功能的免疫球蛋白<'[3]>。由于雞屬于非哺乳動(dòng)物,與人類親緣關(guān)系較遠(yuǎn),故它對(duì)人類的病原體具有強(qiáng)免疫應(yīng)答。膠質(zhì)瘤IgY抗體能特異而選擇性的識(shí)別腦膠質(zhì)瘤組織,因此它可以作為一種小型而高效的導(dǎo)向載體把毒素有目的地運(yùn)輸?shù)侥[瘤細(xì)胞上,當(dāng)載體識(shí)別腫瘤細(xì)胞后,立即與腫瘤細(xì)胞結(jié)合而釋放毒素,從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞而不影響其它正常細(xì)胞的目的<'[4]>。此外IgY的制備成本低且產(chǎn)量高,亦無(wú)毒副作用,將成為大規(guī)??贵w制備的一種有效手

3、段。本研究旨在制備人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 IgY抗體,并對(duì)其基本特性進(jìn)行分析、鑒定,從而為腦腫瘤的診治提供新的思路。 方法:1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所惠贈(zèng)的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251,于37℃、5﹪CO<,2>條件下常規(guī)培養(yǎng)、傳代。 2.本研究所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為購(gòu)于遼寧省遼陽(yáng)益康生物制品廠的京白雞,正常飼養(yǎng)一周后,準(zhǔn)備用于免疫。 3.收集長(zhǎng)勢(shì)良好的U251細(xì)胞用生理鹽水配制成懸液,按照10<'9>個(gè)細(xì)

4、胞/只雞免疫產(chǎn)蛋京白雞,初次免疫時(shí)需要加入等量的福氏完全佐劑,分別于雙翅膀皮下,左右背部皮下進(jìn)行點(diǎn)注射。免疫一周后,逐日收集其所產(chǎn)的蛋,標(biāo)記好時(shí)間,4℃保存?zhèn)溆谩?4.本研究以免疫前及免疫后第15、20、25、30、35、40、45天收集到的雞蛋為研究對(duì)象,去除蛋清,收集卵黃液經(jīng)過蒸餾水粗提,50﹪飽和硫酸銨鹽析,透析、以及聚乙二醇濃縮等步驟得到純化的 IgY 抗體<'[5],這里我們將其命名為AG-IgY(Against gl

5、ioma IgY)。蛋白質(zhì)定量后,再通過免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法對(duì)所提抗體進(jìn)行鑒定。結(jié)果:經(jīng)抗原免疫的母雞,10天左右就可從其所產(chǎn)蛋的卵黃中檢測(cè)出特異性IgY抗體,抗體量在35天左右達(dá)到高峰,每個(gè)雞蛋可收獲100~200mg抗體。其熱穩(wěn)定性、耐酸性均較好,效價(jià)可以持續(xù)2~6個(gè)月。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示,AG-IgY抗體與IJ251膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),陽(yáng)性部位主要位于細(xì)胞膜

6、及細(xì)胞質(zhì)。經(jīng)純化的AG-IgY通過還原性SDS-PAGE顯示兩條帶,其分子量約為70kD和20kD。ELISA結(jié)果顯示,IgY與肝癌、肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤細(xì)胞L187等其他抗原之間無(wú)交叉反應(yīng)。Westem blot檢測(cè)所得結(jié)果完全相同。 結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)成功制備獲取了抗人腦膠質(zhì)瘤的IgY抗體。 2.通過對(duì)其理化性質(zhì)、SDS-PAGE、Westem blot以及ELISA的研究結(jié)果表明,AG-IgY抗體是一種耐酸、耐熱、

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