CPEB4在人腦膠質瘤中的表達及其對膠質瘤細胞株增殖、凋亡和侵襲力的影響.pdf

1、腦膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，約占成人顱內腫瘤的35.26％-60.96％(平均44.69％)。由于其浸潤性生長，在腫瘤與正常組織之間常無明顯的邊界，因此手術治療難以徹底切除腫瘤組織。盡管我們努力嘗試各種治療方法，但是腦膠質瘤仍然無法治愈。這就要求我們?yōu)槟z質瘤的治療尋找新的策略。近年來，隨著基因工程技術的發(fā)展，人們開始從分子生物學的角度探求腦膠質瘤的發(fā)病機制，腦膠質瘤的基因治療逐漸受到關注。CPEB4是新近發(fā)現的胞質多聚腺

2、苷酸化元件結合蛋白(CPEBs)家族中的一員，是一種具有序列特異性的RNA結合蛋白，含有一個RNA識別基序和一個鋅指結構，位于人染色體5q21區(qū)域，定位于細胞質，長度為7769bp。胞質多聚腺苷酸化元件結合蛋白(CPEBs)于大約二十年前被首次發(fā)現在卵母細胞成熟過程中，其在已確定的信使RNA的翻譯過程中起著重要的調控作用，人們在早期做了很多關于CPEB控制胞質多聚腺苷酸化和翻譯的工作，發(fā)現CPEB通過調控mRNA這一活動而影響諸多進程如

3、生殖細胞的發(fā)育、細胞分裂與細胞衰老、突觸可塑性以及學習與記憶等。然而，關于近年CPEBs的一些熱點研究表明它不僅在體細胞組織表達，而且在控制成年有機體時間和空間的基因表達方面具有重要的功能。這些新發(fā)現的功能包括調節(jié)衰老和增殖之間的平衡，及腫瘤的發(fā)生等。CPEBs在各種組織和腫瘤中高度表達，且有部分重疊。最近的一項新研究表明，CPEB4在胰腺癌和膠質母細胞瘤中高度表達，這與腫瘤的生長、惡性度的增加及血管生成等有關。然而，CPEB4在腦膠質

4、瘤中的表達沒有被詳細描述。
　　鑒于以上研究背景，我們通過施行免疫組織化學、蛋白免疫印跡以及實時熒光定量PCR等實驗方法，檢測了CPEB4在正常腦組織和不同級別腦膠質瘤的蛋白及RNA水平的表達情況。此外，應用RNA干擾技術敲減膠質瘤細胞系中CPEB4的表達，來探究其在膠質瘤細胞增殖、凋亡和侵襲中的作用。本實驗研究包括以下三個部分:
　　第一部分、CPEB4在人腦膠質瘤組織中的表達及其臨床意義
　　目的:探討CPEB4在

5、正常腦組織中和各級別腦膠質瘤組織中的表達情況。
　　方法:
　　1.收集樣本:收集2011年10月至2012年11月期間在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院住院，經行手術切除的63例腦膠質瘤組織及9例正常腦組織。腫瘤標本均由神經病理醫(yī)師確診，正常腦組織取自腦出血或腦外傷需行內減壓術的患者。每例患者分兩部分留取標本，一部分置于10％福爾馬林液中固定，另一部分保存于2ml無菌凍存管并立即投至液氮中速凍。
　　2.應用免疫組織化學法檢測:

6、9例正常腦組織及63例膠質細胞瘤組織中CPEB4蛋白的表達情況，并比較其表達差異，分析其與腦膠質瘤病理級別的相關性。
　　3.應用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time qPCR)測定CPEB4 mRNA的表達水平。
　　4.應用蛋白質免疫印跡Western blot檢測正常腦組織及膠質瘤組織中CPEB4蛋白的表達。
　　結果:
　　1.免疫組織化學結果:CPEB4在膠質細胞瘤組織中的總陽性表達率為88.8

7、9％(56/63)，CPEB4在9例正常腦組織中表達呈陰性或很弱，腦膠質瘤組織的CPEB4陽性表達率明顯高于正常腦組織，具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.01);低級別（Ⅰ、Ⅱ級）和高級別（Ⅲ、Ⅳ級）膠質瘤組織陽性表達率分別為75％(15/20)和95.4％(41/43)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.Western blot結果:CPEB4蛋白在腦膠質瘤組織中的表達明顯高于正常腦組織。 CPEB4蛋白在正常腦組織及Ⅰ

8、、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級腦膠質瘤中相對表達量分別為0.070±0.012，0.417±0.044，0.495±0.043，0.709±0.080，0.713±0.027。CPEB4蛋白在低級別（Ⅰ、Ⅱ級）腦膠質瘤中的表達量低于高級別（Ⅲ、Ⅳ級）(P＜0.05)。
　　3.Real-time qPCR結果:CPEB4mRNA在正常腦組織、低級別及高級別中相對表達沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結論:
　　1.免疫組化與Wes

9、tern blot檢測均得出CPEB4蛋白在人腦膠質瘤組織中高度表達，并且其表達隨著膠質瘤病理級別的增高而增加，Ⅲ、Ⅳ級腦膠質瘤中CPEB4蛋白表達要高于Ⅰ、Ⅱ級腦膠質瘤，差異顯著;但是，在mRNA水平，CPEB4的表達卻無明顯差異。對于這種蛋白水平與RNA水平表達不一致的情況，我們分析可能是與此RNA的穩(wěn)定性差、易降解有關。
　　2.CPEB4的高表達與膠質瘤級別的升高呈顯著的正相關，可作為腦膠質瘤臨床分級的重要指標。
　

10、　第二部分、 CPEB4在人腦膠質瘤細胞株U87、U251中的表達
　　目的:檢測CPEB4在人腦膠質瘤細胞株U87和U251中的表達情況，選出CPEB4表達量較高的細胞株以進行進一步的生物學功能試驗。
　　方法:
　　1.應用蛋白質免疫印跡Western blot檢測U87和U251細胞中CPEB4蛋白表達情況。
　　2.應用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time qPCR)測定U87和U251細胞中CP

11、EB4mRNA的表達。
　　結果:人腦膠質瘤細胞株U87的CPEB4蛋白和mRNA均高于U251(P＜0.05)。
　　結論:U87細胞株可被選擇作為CPEB4的優(yōu)勢表達株，進一步行以CPEB4為研究靶點的生物學功能試驗。
　　第三部分、CPEB4慢病毒載體感染人腦膠質瘤細胞株U87及其對U87細胞增殖、凋亡和侵襲力的影響研究
　　目的:構建CPEB4干擾慢病毒載體，以構建好的CPEB4siRNA干擾慢病毒載體感

12、染U87細胞株，探討RNA干擾(RNAinierference，RNAi)對膠質瘤細胞株U87中CPEB4表達的抑制作用及其對U87細胞增殖、凋亡和侵襲力的影響。
　　方法:
　　1.構建CPEB4干擾慢病毒載體:針對目的基因CPEB4的序列信息，嚴格按照RNA干擾序列設計原則，設計3個RNA干擾靶點序列，合成SiRNA并向U87細胞分別轉染3種si RNA，利用western blot篩選干擾效果最佳的siRNA，根據此s

13、iRNA序列，合成雙鏈DNA Oligo，兩端帶有BamHⅠ和ECORⅠ酶切位點粘性末端，退火后得到的雙鏈產物無需酶切可直接連入BamHⅠ和ECORⅠ線性化的pSRL-SIH1-H1-GFP載體。將連接產物轉入細菌感受態(tài)細胞，提取細菌培養(yǎng)物中的質粒，對長出的克隆抽提質粒并酶切鑒定，然后進行測序比對，鑒定陽性克隆即為構建成功的CPEB4 RNA干擾慢病毒載體。
　　2.在體外應用RNA干擾技術以siCPEB4(CPEB4 SiRNA

14、)靶向感染膠質瘤細胞株U87，分為轉染組、陰性對照組和空白對照組;
　　3.應用Western blot和Real time qPCR分別檢測CPEB4-siRNA慢病毒感染U87細胞后1天、2天、3天、4天、5天細胞中CPEB4蛋白和mRNA相對表達量變化;
　　4.應用流式細胞技術(FCM)檢測CPEB4 SiRNA慢病毒感染U87細胞后的細胞周期變化，并檢測分析轉染前后細胞凋亡水平變化;
　　5.應用MTT比色實

15、驗檢測分析感染CPEB4-SiRNA慢病毒1天、2天、3天、4天、5天、6天及7天后U87細胞的增殖情況;
　　6.應用Transwell侵襲實驗檢測分析轉染前后細胞體外侵襲能力的變化。
　　結果:
　　1.成功構建并包裝了攜帶CPEB4基因的慢病毒表達載體，經過陽性克隆測序證實插入序列完全正確;
　　2.Western blot和Real time qPCR結果顯示，慢病毒感染組的CPEB4蛋白和mRNA相對表

16、達量明顯低于空白對照組與陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);空白對照組與陰性對照組間表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);
　　3.流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示，相對于陰性對照組細胞以及空白對照組細胞，轉染CPEB4 siRNA慢病毒后U87細胞阻滯于G1期，S期細胞數相對較少;陰性對照組和空白對照組的U87細胞的細胞狀態(tài)和細胞周期沒有變化;流式細胞儀分析各組細胞的凋亡水平顯示，相對于空白對照組細胞（0.13±0.08）

17、％和陰性對照組細胞（0.47±0.12）％，U87細胞感染CPEB4 si-RNA慢病毒后早期凋亡率增加，達(19.16±3.85)％，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01);
　　4.MTT檢測細胞活性顯示，從第三天起，與陰性對照組(0.476±0.048)和未轉染組（0.495±0.031）相比，慢病毒感染組（0.42±0.05）細胞生長速度開始減慢，并具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，且隨感染時間的延長，抑制程度越來越明顯。而未轉染組

18、與陰性對照組組之間無明顯差異(P＞0.05)。說明CPEB4 siRNA對U87細胞生長增殖具有顯著抑制作用;
　　5.Transwell侵襲試驗結果顯示，經CPEB4 siRNA慢病毒感染后，U87細胞穿膜數量明顯減少，低于陰性對照組及空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。換句話說，CPEB4能夠促進膠質瘤細胞的體外侵襲力。
　　結論:CPEB4靶向轉染能夠有效敲減這個基因在人腦膠質瘤U87細胞系內的表達，使腫瘤細胞增殖和侵襲能