沙利度胺對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠VEGF、TNF-α表達及紅細胞生成的影響.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一類以慢性、對稱性、多關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，其侵犯的靶器官主要是關(guān)節(jié)滑膜，最終可影響關(guān)節(jié)功能甚至致殘。RA 滑膜新生血管的生成是產(chǎn)生和維持血管翳的重要標(biāo)志，也是造成滑膜炎、血管翳生長、骨破壞的主要原因。因此抑制滑膜組織血管生成、減少其引起的骨破壞將成為治療RA的重要方法。RA 滑膜組織中有多種促血管生成因子高表達，其中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在滑膜炎進展及

2、新生血管形成過程中的作用至關(guān)重要。VEGF的表達受多種因素影響，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、缺氧、白細胞介素-1(IL-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)及CD40-CD40L 等均可以上調(diào)其表達。做為RA細胞因子網(wǎng)絡(luò)瀑布啟動的起點，TNF-α在RA 病程中發(fā)揮著樞紐作用，它與VEGF相互促進，相互影響，加速病變的進程。 貧血是RA最常見的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，常與RA的活動相一致。目前認為RA患者的貧血多屬慢性病貧血(ACD)，是活

3、動性RA的一種常見特征，可能與鐵吸收異常、巨噬細胞釋放鐵障礙、促紅細胞生成素(EPO)表達缺陷等有關(guān)。另外細胞因子如 TNF-α、IL-6 等已被證實與ACD發(fā)病明顯相關(guān)。它們可以直接抑制紅系祖細胞增殖、抑制。EPO的產(chǎn)生、遲化骨髓對EPO的反應(yīng)及干擾鐵代謝等多個環(huán)節(jié)。 沙利度胺因免疫調(diào)節(jié)、抗炎及抗血管生成作用又重新成為臨床研究的熱點，證實它對某些腫瘤、風(fēng)濕性疾病、難治性血液病以及多種原因不明的疾病療效顯著。迄今為止僅有少數(shù)關(guān)于

4、沙利度胺治療RA的臨床報導(dǎo)，對其療效褒貶不一，作用機制亦不明確，無遠期療效的臨床及相關(guān)動物實驗資料，也未見其對RA伴貧血患者紅系生成方面的臨床及動物實驗的報道。 為此，本實驗在傳統(tǒng)的膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎基礎(chǔ)上加以改進，通過多次皮內(nèi)注射Ⅱ型膠原與弗氏完全佐劑，成功地建立了關(guān)節(jié)炎伴貧血的動物模型。從細胞水平、形態(tài)學(xué)、流式檢測、分子生物學(xué)等多種角度，有機結(jié)合體內(nèi)和離體試驗，以 VEGF與 TNF-α為切點，以動態(tài)觀察的方式研究并探討沙利度

5、胺對關(guān)節(jié)炎大鼠的炎性活動、血管生成、滑膜細胞表達及凋亡的影響以及對紅細胞生成作用及可能機制，進一步評價不同劑量的沙利度胺在實驗性關(guān)節(jié)炎伴貧血大鼠的療效及臨床應(yīng)用價值，試圖為該藥在RA新靶點治療——阻斷血管生成方面及選擇無明顯骨髓抑制的抗風(fēng)濕藥物方面提供一定的實驗依據(jù)。 實驗內(nèi)容主要包括以下四個部分： 第一部分：VEGF、TNF-α在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠病程中的動態(tài)表達及沙利度胺的影響 目的：探討VEGF、TNF-

6、α mRNA 及其蛋白在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清及滑膜中的動態(tài)表達及其與關(guān)節(jié)炎活動程度的關(guān)系、滑膜微血管密度的變化及沙利度胺對上述指標(biāo)的影響。 方法：將128只雄性Wistar大鼠隨機分5組，Ⅰ組：正常對照組(n=24)，Ⅱ組：造模組(n=26)，Ⅲ組：造模組+高劑量沙利度胺治療組(200mg/kg/d，n=26)，Ⅳ組：造模組+沙利度胺低劑量治療組(100mg/kg/d，n=26)，V組：造模組+甲氨喋呤(MTX)治療組(2.

7、7mg/kg/w，n=26)。通過注射Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑(complete freud’s adjuvant，CFA)制作膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)動物模型，各CIA 模型組又根據(jù)初次免疫后不同時間點(7、14、21、28、35、42及60天)各分為7個亞組。造模后12天開始給藥。應(yīng)用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)、足爪厚度、<'99m>Tc-MDP 核素顯像

8、、x線、電鏡及病理改變評價模型建立情況；RT-PCR、ELISA及免疫組織化學(xué)方法檢測VEGF及 TNF-α tuRNA 和其蛋白在不同時期關(guān)節(jié)炎大鼠血清及滑膜組織中含量的動態(tài)變化；采用CD31 免疫組織化學(xué)方法及微血管計數(shù)(microvessel density，MVD)法了解滑膜組織新生血管情況；研究沙利度胺對上述指標(biāo)的影響并與MTX比較，同時比較不同劑量沙利度胺的作用有無差別。 結(jié)果：①CIA大鼠的AI指數(shù)、足爪厚度及核素

9、濃聚程度在21天達到高峰，其中關(guān)節(jié)部位核素的變化敏感性及客觀性均優(yōu)于其它指標(biāo)，更能夠反應(yīng)關(guān)節(jié)的早期病變。②CIA大鼠滑膜組織中的VEGF和 TNF-α mRNA在造模后21天表達水平分別為0.75±0.06和2.01±0.13，明顯高于同期對照組，P<0.01。僅高劑量沙利度胺組可以下調(diào)VEGF mRNA的表達，高、低劑量沙利度胺和MTX組都能夠下調(diào)TNF-α mRNA的表達。③免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示CIA大鼠滑膜層中VEGF和 TN

10、F-α蛋白的表達以造模后21天最強，分別為15683.15±319.23和9037.71±403.03，顯著高于同期對照組值，P<0.01。且都與大鼠足爪厚度改變呈正相關(guān)，r 值分別為0.915和0.664，P<0.01。高、低劑量沙利度胺和MTX都能降低滑膜層中VEGF和 TNF-α蛋白的含量，高劑量沙利度胺起效最快。④CIA大鼠血清中VEGF和 TNF-α的濃度也在造模后21天達峰值，分別為2147.3±37.56 pg/mL 和2

11、685.0±112.09 pg/mL，與同期對照組值比較顯著升高，P<0.01。3個治療組都能降低血清 VEGF和TNF-α的濃度，高劑量沙利度胺與MTX作用接近。⑤CIA大鼠滑膜的MVD在造模后28天達峰值為22.45±2.43，與同期對照組比較差異顯著，P<0.01。 結(jié)論：CIA大鼠病程中血清和滑膜組織中VEGF和 TNF-α存在高表達，并與關(guān)節(jié)腫脹程度相一致，關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)的新生血管明顯增加，沙利度胺均可有效下調(diào)VEGF

12、 和TNF-α mRNA及其蛋白的表達，減少滑膜組織的MVD，改善CIA大鼠的關(guān)節(jié)癥狀，效果優(yōu)于或等同于MTX。高劑量沙利度胺對上述指標(biāo)的影響更顯著。 第二部分：沙利度胺對關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細胞VEGF、TNF-α表達水平和對細胞凋亡的影響 目的：探討沙利度胺對脂多糖(LPS)刺激的成纖維細胞樣的滑膜細胞(FLS)VEGF和TNF-α mRNA及其蛋白表達的作用及對FLS凋亡的影響。 方法：無菌獲取關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)的

13、滑膜組織，應(yīng)用體外FLS 的培養(yǎng)技術(shù)進行滑膜細胞的分離與培養(yǎng)。實驗共分6組：對照組，LPS組，LPS+高劑量沙利度胺組(50 mg/L)，LPS+中劑量沙利度胺組(5 mg/L)，LPS+低劑量沙利度胺組(0.5 mg/L)組及LPS+MTX組。倒置顯微鏡及透射電鏡觀察體外培養(yǎng)的FLS的形態(tài)：ELISA方法檢測FLS培養(yǎng)上清中VEGF和 TNF-α的含量；RT-PCR、Western Blot方法檢測FLS中VEGF和 TNF-α mR

14、NA及蛋白表達的變化；膜聯(lián)蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(PI)雙標(biāo)記流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)測定藥物對FLS 凋亡的影響。 結(jié)論：FLS可以通過體外細胞培養(yǎng)及傳代法獲得并逐漸純化，沙利度胺可以誘導(dǎo)FLS凋亡，并能夠抑制其分泌和表達 VEGF、TNF-α，且呈部分劑量依賴關(guān)系。 第三部分：沙利度胺對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎伴貧血大鼠血紅蛋白的影響 目的：研究并探討沙利度胺對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎

15、伴貧血大鼠的治療作用及臨床應(yīng)用價值。 方法：在傳統(tǒng)的Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型基礎(chǔ)上加以改進，制作關(guān)節(jié)炎伴貧血的動物模型，具體方法及分組同第一部分，并根據(jù)初次免疫后不同時間點(14、21、28、35、42及60天)各分為6組。測定不同時間點血紅蛋白濃度，了解貧血出現(xiàn)時間及規(guī)律：測定模型組血清鐵、血清總鐵結(jié)合力、血清鐵蛋白、促紅細胞生成素(EPO)，獲取骨髓液觀察骨髓細胞形態(tài)、測定骨髓內(nèi)外鐵變化了解貧血類型；測定并分析不同時間點

16、血清TNF-α濃度、大鼠足爪厚度及與血紅蛋白三者之間的相關(guān)性；分析EPO與血紅蛋白之間的相關(guān)性。 結(jié)論：通過改良CIA 模型的方法，可成功制作出關(guān)節(jié)炎伴貧血的大鼠模型。關(guān)節(jié)炎腫脹程度越大，TNF-α濃度越高；TNF-α濃度越高，貧血也越嚴重。沙利度胺能夠改善貧血及大鼠關(guān)節(jié)腫脹，降低血清 TNF-α濃度，有望為臨床RA伴ACD患者的治療開辟一條新途徑。 第四部分：沙利度胺對關(guān)節(jié)炎伴貧血大鼠紅系祖細胞的影響及可能機制

17、 目的：研究并探討沙利度胺對關(guān)節(jié)炎伴貧血大鼠紅系祖細胞的影響。 方法：雄性Wistar大鼠40只隨機分5組，造模方法及處理因素同第三部分。于造模后第3及第8周處死大鼠，剪斷股骨兩端，獲取骨髓液，大鼠淋巴細胞分離液分離獲得骨髓單個核細胞(BMMCs)，臺盼蘭染色記數(shù)活細胞，在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中進行骨髓紅系祖細胞的培養(yǎng)及集落數(shù)目的測定；流式細胞學(xué)測定骨髓紅系祖細胞CD34<'+>及CD71<'+>的表達情況，應(yīng)用7-氨基放線菌