用于轉染細胞分選的雙順反子載體的構建及其應用.pdf

1、將外源基因導入哺乳動物細胞并獲得表達外源基因的細胞系，在生物學及基礎醫(yī)學研究中有著廣泛的應用。動物細胞被外源基因轉化通常是一種低效率的過程，在幾萬或幾十萬個細胞中僅有少數(shù)幾個細胞可整和外源基因，即使對于高效率的轉化方法，所產(chǎn)生的轉化株也是少數(shù)。如何從大量的未轉染的細胞中選出轉化株，是基因轉移技術十分關鍵的一環(huán)。 傳統(tǒng)的方法中，用于哺乳動物細胞基因工程的載體通常需要外加一個遺傳標記基因以便于進行選擇。例如，利用載體攜帶的抗生素抗性

2、基因，通過一定濃度的選擇性培養(yǎng)基進行一段時間的加壓培養(yǎng)，然后挑取單克隆擴大培養(yǎng)，經(jīng)過鑒定獲得所要的細胞系。但是載體中由于目的基因和抗生素抗性基因分別由不同的啟動子啟動，往往不能實現(xiàn)共同表達，所以采用傳統(tǒng)的方法獲得表達目的基因的細胞系，工作量大，所需時間也長。 免疫磁珠分選(MagneticCellSorting，MACS)技術由于其快速、高效并且具有可供利用的試劑盒等特點，目前已廣泛應用于細胞的分選。此項技術基于抗體對細胞表面抗

3、原的特異識別，將偶聯(lián)在抗體上的磁珠標記在細胞上，在磁場作用下達到分離細胞的目的。我們將MACS分選技術引入到轉染細胞的分選中，通過構建一個帶有細胞表面標記基因CD34的雙順反子載體，使轉染細胞在表達目的基因的同時表達CD34標記基因，然后通過MACS分選來獲得所需的表達目的基因的細胞系。 CD34是屬于Ⅰ型跨膜蛋白的磷酸糖蛋白，主要表達于造血干/祖細胞(hematopoieticstem/progenitorcell，HSC/H

4、PC)上。我們利用從CD34+細胞中提取的RNA反轉錄得到的cDNA為模板，PCR擴增得到CD34的一種人工截短體形式dCD34(delectedvariantofCD34)。將其克隆入pGEM-T-easy載體中，測序證明其包含了完整的胞外域及跨膜部分，但是缺失了胞內域。 為了實現(xiàn)目的基因與CD34基因的共表達，我們采用內部核糖體進入位點(internalribosomeentrysite，IRES)序列構建了雙順反子表達載體

5、。在上游啟動子的控制下，IRES序列及與之相連的基因可同時轉錄，并以不依賴帽的方式啟動遠端mRNA的翻譯，從而在同一轉錄本上翻譯出不同的蛋白。我們將酶切得到的IRES及CD34片段分別連接入pGEM-T-easy載體，然后酶切出IRES-CD34片段，將其克隆入pcDNA3.1(+)載體，構建了雙順反子載體p3.1-IRES-CD34。此載體中在多克隆位點后包含了一個IRES序列及CD34基因，目的基因插入載體的多克隆位點后轉染細胞，轉

6、染的細胞在表達目的基因的同時表達CD34基因，然后利用細胞表面帶有的CD34標志，采用免疫磁珠分選的方法得到所需的表達目的基因的細胞。 為了驗證這個載體在轉染細胞分選中的作用，我們選擇了綠色熒光蛋白(EnhancedGreenFluorescentProtein，EGFP)基因作為目的基因。利用PCR克隆技術從載體pIRES2-EGFP擴增得到EGFP，插入載體p3.1-IRES-CD34的多克隆位點，構建了載體p3.1-IRE

7、S-CD34-EGFP。將載體p3.1-IRES-CD34-EGFP利用脂質體轉染法轉染NIH-3T3細胞，對于瞬時轉染及穩(wěn)定轉染的細胞分別采用了MACS分選的方法富集陽性細胞。 結果表明，對于瞬時轉染的細胞，經(jīng)MACS分選后，收集到的陽性細胞中表達綠色熒光蛋白的細胞百分率明顯提高，在熒光顯微鏡下觀察，有大于95％的細胞發(fā)出綠色熒光。流式細胞儀分析表明，轉染細胞經(jīng)MACS分選后，陽性細胞中表達CD34(PE陽性)的細胞百分率提高

8、到了88％，表明目的基因與細胞表面標記基因CD34實現(xiàn)了較好的協(xié)同表達。對于穩(wěn)定轉染細胞的分選，亦可得到同樣的結果。 另外，由于在用MACS分選細胞時，如果其中待分選的含特定表面標志的細胞含量太低(例如低于1％)，則經(jīng)過一次MACS分選只能少量地提高其純度，這時需要進行多次MACS分選才能獲得較純的細胞。對于轉染效率較低的轉染細胞的分選，為了能夠只經(jīng)過一次免疫磁珠分選即能夠得到較純的目的細胞，我們利用載體p3.1-IRES-CD

9、34所含有的新霉素(neomycin)基因，采用了一個改進的方法。在轉染細胞擴大培養(yǎng)的過程中，通過含有較低濃度G418的選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，殺死一部分未轉染的細胞，使得表達目的基因的細胞比例升高，以提高免疫磁珠分選的分選效率。結果表明，對于轉染效率較低的細胞，通過這種方法，經(jīng)MACS分選后表達目的基因的細胞含量可達到95％以上。 綜上，本課題提供了一種與傳統(tǒng)方法不同的分選轉染細胞的方法并構建了一個可以用于轉染細胞分選的雙順反子