HLA-G和FasL慢病毒載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染人胚胎干細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建免疫豁免分子HLA-G和FasL的慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)過293T細(xì)胞包裝后感染人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，hES)，篩選出能穩(wěn)定表達(dá)HLA-G和FasL的hES細(xì)胞陽性克隆，分別建立能夠穩(wěn)定地構(gòu)成性表達(dá)HLA-G、FasL和HLA-G-FasL的hES細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究這些細(xì)胞系的生物學(xué)特性，并最終建立免疫豁免的人類組織工程種子細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴HLA-G慢病毒表達(dá)載體

2、的構(gòu)建:從正常孕婦剖宮產(chǎn)后胎盤提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，設(shè)計(jì)對應(yīng)引物PCR擴(kuò)增出HLA-G產(chǎn)物并回收;將目的基因片段與帶有EGFP熒光標(biāo)記和新霉素篩選標(biāo)記的EX-NEG-Lv183空白載體連接為重組HLA-G慢病毒表達(dá)載體EX-HLA-G-Lv183并測序。⑵FasL慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建:設(shè)計(jì)引物從EX-L0009-M02載體上分離出FasL片段并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將回收的目的片段與帶有mcherry熒光標(biāo)記和嘌呤霉素篩

3、選標(biāo)記的的EX-NEG-Lv111空白載體連接為重組FasL慢病毒表達(dá)載體EX-FasL-Lv111并測序。⑶重組慢病毒表達(dá)載體的包裝:將上述構(gòu)建的兩種表達(dá)載體分別與HIVpacking mix包裝質(zhì)粒按1∶1稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)液中，并與同樣稀釋于Opti-MEM中的2.5倍含量的Lipofectamine2000脂質(zhì)體混合后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞6小時(shí)，換液后48小時(shí)觀察熒光判斷包裝效率并提取上清液測定滴度。⑷hES的擴(kuò)增:人胚胎干

4、細(xì)胞(hES)接種于經(jīng)絲裂霉素處理的飼養(yǎng)層MEF上，在含20％ knockout SR血清，78％DMEM/F12培養(yǎng)液，1％NEAA，1％L-谷氨酰胺以及0.1％β-巰基乙醇和BFGF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每天換液一次，每3-4天按1∶2比例傳代擴(kuò)增一次。⑸HLA-G/FasL慢病毒感染hES細(xì)胞:將病毒液和溴化季銨陽離子(Polybrene)加入到無飼養(yǎng)層條件下培養(yǎng)的hES中培養(yǎng)2小時(shí)后補(bǔ)加同體積病毒液，2小時(shí)后離心hES2-3次后加到飼

5、養(yǎng)層上常規(guī)培養(yǎng)。48小時(shí)后觀察熒光表達(dá)。
　　 結(jié)果：①經(jīng)過電泳及測序鑒定成功構(gòu)建了含有EGFP熒光標(biāo)記和新霉素篩選標(biāo)記的重組HLA-G慢病毒表達(dá)載體EX-HLA-G-Lv183。②經(jīng)過電泳及測序鑒定成功構(gòu)建了含有mcherry熒光標(biāo)記和嘌呤霉素篩選標(biāo)記的重組FasL慢病毒表達(dá)載體EX-FasL-Lv111。③包裝載體過程中摸索發(fā)現(xiàn)在載體與轉(zhuǎn)染試劑比例為1∶2.5且轉(zhuǎn)染時(shí)間為6小時(shí)的情況下，表達(dá)載體包裝效率最高。在此條件下包裝質(zhì)

6、粒并提取病毒上清液，用孔稀釋法測定兩種載體包裝后的病毒滴度分別為1.0×109TU/ml和5.3×108TU/ml，具備感染目的細(xì)胞的條件。④MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備:將取自孕13.5天的小鼠胚胎的胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）進(jìn)行傳代培養(yǎng)至2-3代，當(dāng)細(xì)胞匯合度到達(dá)80％時(shí)用濃度為10μg/ml的絲裂霉素C處理2小時(shí)可明顯抑制MEF的分裂，形成利于hES細(xì)胞生長的飼養(yǎng)層細(xì)胞。⑤hES細(xì)胞的

7、培養(yǎng):在含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的條件下每天換液可保證絕大多數(shù)細(xì)胞在4-5天內(nèi)不斷生長且不發(fā)生分化。在無飼養(yǎng)層條件下，hES細(xì)胞在Matrigel處理過的細(xì)胞培養(yǎng)板上可貼壁生長至細(xì)胞匯合度到達(dá)40％。⑥分別用HLA-G，F(xiàn)asL慢病毒液感染hES細(xì)胞，感染48h后在熒光顯微鏡下可觀察到帶有相應(yīng)熒光標(biāo)記的陽性細(xì)胞。
　　 結(jié)論：⑴本實(shí)驗(yàn)使用總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄PCR的方法可以從人胎盤組織中擴(kuò)增出HLA-G目的基因片段，并成功構(gòu)建了HLA-G

8、重組慢病毒載體EX-HLA-G-Lv183。⑵本實(shí)驗(yàn)使用PCR方法可以從含有目的基因片段的哺乳動物真核表達(dá)載體中擴(kuò)增出FasL目的基因片段，并成功構(gòu)建了FasL重組慢病毒載體EX-FasL-Lv111。⑶本實(shí)驗(yàn)摸索出在慢病毒載體與轉(zhuǎn)染試劑Lipofactamine2000比例為1∶2.5且轉(zhuǎn)染時(shí)間為6小時(shí)的情況下，包裝效率最高且可以收集獲得較高的病毒滴度。⑷hES細(xì)胞在Matrigel處理過的培養(yǎng)板上可以貼壁生長，雖然比在相同培養(yǎng)液條件