靶向MDR1基因RNAi腺病毒載體的構(gòu)建及肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究.pdf

1、目的：構(gòu)建針對MDR1的RNAi腺病毒載體，轉(zhuǎn)染肝癌耐藥細(xì)胞株SMMC-7721/ADM，研究其對肝癌耐藥細(xì)胞MDR1基因表達的影響，以及對P-糖蛋白(P-gP)表達和功能的抑制作用。 方法：1.通過分析PGE-1和pshMDR1基因序列，找到包含U6啟動子和shRNA序列的完整shRNA表達單元，并且包含兩個酶切位點XhoI和XbaI,與pshuttle的MCS的酶切位點吻合。利用XhoI和XbaI雙酶切將shRNA表達單元構(gòu)

2、建到pshuttle，命名為pshuttleMDR1。2.將我們構(gòu)建的pshRNA-MDR1經(jīng)PmeI酶切成線形質(zhì)粒，再進行去磷酸化以防止其自身環(huán)化，與腺病毒骨架質(zhì)粒PAdeasy共同轉(zhuǎn)化含重組酶的BJ5183菌株內(nèi)完成重組腺病毒質(zhì)粒PAd-MDR11。3.質(zhì)粒PAd-MDR11經(jīng)PacI酶切后產(chǎn)物加入到AD293細(xì)胞培養(yǎng)后完成病毒顆粒包裝。4.將病毒感染肝癌耐藥細(xì)胞株SMMC-7721/R流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜表面P-gp表達和細(xì)胞內(nèi)R

3、hdaming123(Rh123)的儲留(P-gp功能試驗)，激光掃描共聚焦顯微鏡測定細(xì)胞內(nèi)Rh123的分布，WesternBlot檢測P-gp含量。 結(jié)果： 1.重組構(gòu)建的pshRNA-MDR1及Padeasy-shMDR1載體經(jīng)過PCR擴增后電泳分析均顯示在相對分子質(zhì)量600bp左右處有一條明亮的條帶，符合陽性克隆的特性。 2.羅丹明123與細(xì)胞共培養(yǎng)30后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示，PAd-MDR11和PAd

4、-MDR13轉(zhuǎn)染的細(xì)胞平均熒光強度顯著高于SMMC-7721/R細(xì)胞系細(xì)胞，陽性率為分別91.5％、90.8％，后者陽性率為29.7％，差異顯著(p＜0.05)。 3.用間接免疫熒光法檢測細(xì)胞膜表面P-gp，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測可見各組細(xì)胞的陽性率分別是：SMMC-7721/S，26.3％；SMMC-7721/R,85.3％；SMMC-7721/R+PAd-MDR1122.9％；SMMC-7721/R+PAd-MDR1330.8％；