高危型HPV致癌基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染人口腔上皮細(xì)胞.pdf

1、目的：
　　人乳頭瘤病毒（HPV）是一種雙鏈環(huán)狀小DNA病毒，與宮頸癌密切相關(guān)，95％的宮頸癌的病例中均能檢測(cè)到人乳頭瘤病毒。大量的流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，高危型HPV也與口腔癌的發(fā)生密切相關(guān)，目前關(guān)于HPV與口腔癌關(guān)系的研究主要集中于對(duì)高危型HPV E6和E7基因的研究，而忽略對(duì)致癌基因E5的研究。E5基因存在于高危型HPV全基因組，而引起口腔良性腫瘤的低危型HPV基因組一般都缺乏E5基因，或者雖有E5基因但缺乏翻譯E5的起始密碼

2、子；同時(shí)研究表明E5基因在腫瘤形成的早期及增強(qiáng)E6和E7基因?qū)?xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)分別構(gòu)建高危型HPV E5、E6和E73個(gè)癌基因的重組慢病毒載體，成功轉(zhuǎn)染人口腔上皮細(xì)胞，并對(duì)E5基因?qū)谇簧掀ぜ?xì)胞相關(guān)作用進(jìn)行了初步分析，為闡明高危型HPV E5基因與口腔癌的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　(1) PCR擴(kuò)增16型人乳頭瘤病毒（HPV16）E5、E6和E7基因，利用BamH I和EcoR I雙酶切位點(diǎn)構(gòu)建pL

3、VX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和pLVX-AcGFP-E73種慢病毒核心質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證及測(cè)序后，分別將正確的重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)后收集3種慢病毒顆粒上清，濃縮后用逐步稀釋法測(cè)定病毒滴度，并分別感染口腔上皮細(xì)胞，嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，RT-PCR和Western blot檢測(cè)目的基因的表達(dá)。
　　(2)將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染致癌基因的口腔上皮細(xì)胞株分為 A、B、C、D組，其

4、中A組穩(wěn)定感染pLVX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和pLVX-AcGFP-E7慢病毒，B組穩(wěn)定感染pLVX-AcGFP-E6和pLVX-AcGFP-E7慢病毒，C組穩(wěn)定感染pLVX-AcGFP-E5慢病毒，D組穩(wěn)定感染pLVX-AcGFP-N1（空載體）慢病毒，未感染的口腔上皮細(xì)胞作為空白對(duì)照組（E組）。通過比較組與組之間的細(xì)胞黏附率、細(xì)胞增殖能力以及E6、E7基因mRNA水平的表達(dá)量，初步分析E5基因?qū)谇簧掀ぜ?xì)胞的

5、致癌機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　(1)成功獲取E5、E6和E7基因，雙酶切驗(yàn)證和DNA測(cè)序結(jié)果表明，重組慢病毒載體插入序列完全正確。
　　(2)獲得3種慢病毒上清，逐步稀釋法檢測(cè)慢病毒載體pLVX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和 pLVX-AcGFP-E7病毒滴度分別為3×108 TU/ml、2×108 TU/ml和2×108 TU/ml。
　　(3)篩選得到3個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，RT-PCR和Wes

6、tern blot均可檢測(cè)到HPV16 E5、E6和E7基因在口腔上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，即3種慢病毒顆粒成功在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
　　(4)通過對(duì)各組細(xì)胞間的黏附率和細(xì)胞增殖能力比較及分析發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的E5基因不能促進(jìn)口腔上皮細(xì)胞增殖和粘附（P>0.05），E5基因協(xié)同E6和E7基因共轉(zhuǎn)染口腔上皮細(xì)胞能促進(jìn)細(xì)胞的粘附和增值（P<0.05）；Real time-PCR檢測(cè)E6、E7基因表達(dá)量的變化發(fā)現(xiàn)，A組細(xì)胞相比較B組，其E6，E7 mRNA