貝氏隱孢子蟲轉染載體的構建和瞬時轉染.pdf

1、隱孢子蟲病是重要的人獸共患原蟲病。轉染技術是指將外源基因導入真核細胞內，并在細胞內表達的技術。運用轉染技術，構建隱孢子蟲轉染載體，將會為研究隱孢子蟲基因功能，篩選藥物靶基因和保護性抗原基因提供有效的工具。本研究以貝氏隱孢子蟲為模型，以黃色熒光蛋白為標記分子構建隱孢子蟲轉染載體，并通過限制性內切酶介導的整合轉染方法在雞體內建立隱孢子蟲轉染系統(tǒng)。
　　首先，120只雛雞分為5組，分別采用直腸接種子孢子，嗉囊接種卵囊，直腸接種卵囊，嗉囊

2、接種子孢子和嗉囊接種PBS液五種接種方法進行接種。在接種后檢測各組排卵囊情況，并取法氏囊和氣管等組織制作組織切片和掃描電鏡切片。結果發(fā)現(xiàn)，嗉囊接種卵囊和直腸接種子孢子兩個實驗組，相對于嗉囊接種子孢子和直腸接種卵囊組在排卵囊高峰期收集到的卵囊數(shù)量更多，這說明嗉囊接種卵囊和直腸接種子孢子組為本實驗的最佳接種途徑；觀察組織切片和電鏡切片，發(fā)現(xiàn)嗉囊接種卵囊、直腸接種子孢子以及直腸接種卵囊組的法氏囊粘膜層均附著有大量的貝氏隱孢子蟲帶蟲空泡，而僅在

3、嗉囊接種卵囊組的氣管粘膜表面觀察到少量蟲體，感染有卵囊的法氏囊和氣管粘膜層均有不同程度的損傷，這說明不同的接種途徑對貝氏隱孢子蟲不同的寄生部位有著重要的影響。本實驗中直腸接種貝氏隱孢子蟲子孢子和卵囊組的成功感染是首次報道。
　　其次，選擇微小隱孢子蟲和人隱孢子蟲肌動蛋白Actin、組蛋白H4，CP15蛋白調控序列作為參考，利用 PCR技術克隆貝氏隱孢子蟲啟動子和3'-UTR（untranslated region）序列。結果，經(jīng)過

4、PCR擴增、轉化克隆和測序技術，我們最后成功獲得了貝氏隱孢子蟲H4基因的啟動子序列，長度為1295 bp，序列中含81 bp從起始密碼子開始的編碼區(qū)。另外，成功克隆到貝氏隱孢子蟲H4基因3'端轉錄終止調控序列，長度為977 bp。
　　最后，將啟動子，3'-UTR和黃色熒光蛋白序列插入實驗室原保存的載體上，構建了貝氏隱孢子蟲轉染載體 pCbHYH，通過菌落 PCR、酶切和測序方法，鑒定了貝氏隱孢子蟲轉染載體pCbHYH構建的正確性

5、。利用限制性內切酶介導的整合轉染的方法實施轉染，直腸接種子孢子和卵囊方式接種雛雞。轉染的子孢子或卵囊接種雛雞后，在第7天收集的糞便中檢測到發(fā)光的卵囊，且在接種后第11-13天刮取雞法氏囊粘膜，通過熒光顯微鏡觀察到了發(fā)光的隱孢子蟲蟲體，說明在雞體內實現(xiàn)了瞬時轉染。
　　本研究建立了貝氏隱孢子蟲子孢子直腸接種雞的方法，為實現(xiàn)瞬時轉染提供了接種途徑；獲得了貝氏隱孢子蟲轉染載體，實現(xiàn)了雞體內的瞬時轉染。實驗結果將有力的推動隱孢子蟲入侵、代