NF-κB及其抑制物Ⅰ-κB與大腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究.pdf

1、目的：大腸癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，惡性程度較高，發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。盡管治療手段有了很大的進(jìn)步，但五年生存率仍然較低。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因之一，因而，針對(duì)大腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。大腸癌的生物學(xué)行為復(fù)雜多變，預(yù)后影響因素諸多，發(fā)病機(jī)制不十分清楚。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，對(duì)大腸腫瘤的生物學(xué)行為、預(yù)后因素以及發(fā)病機(jī)制已經(jīng)從分子水平有了新的認(rèn)識(shí)。大量研究顯示，核轉(zhuǎn)錄因子кB(Nuclear t

2、ranscription factor kappa B，NFкB)在大腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮了較重要的作用，可能通過調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及惡性轉(zhuǎn)化影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。核轉(zhuǎn)錄因子(NF-кB)是一種分布和作用均十分廣泛的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子．它只有與其抑制因子I-кB(Inhibitor kappa B)解離后方能進(jìn)入胞核，與靶基因上的KB序列特異結(jié)合，上調(diào)這些靶基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。國外研究也表明多種腫瘤組織中存在NF

3、-к3的高表達(dá)和高活性現(xiàn)象。體內(nèi)還存在天然的核因子KB的抑制物I-кB，可以抑制所有NF-кB的活性，影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。I-кB是一類NF-кB的抑制蛋白，通過非共價(jià)結(jié)合，I-кB掩蓋NF-кB的核定位序列(NLS)而阻止NF-кB的核轉(zhuǎn)位。一旦受到信號(hào)分子的刺激，NF-кB就從I-кB中釋放出來，進(jìn)入細(xì)胞核中。I-кB可以抑制NF-кB的活性，影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織中含有較多的NF-кB.

4、然而，目前對(duì)于大腸癌中NF-кB與大腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系的研究較少。本研究采用Western blot分析和免疫組化以及流式細(xì)胞學(xué)三種方法對(duì)大腸癌患者手術(shù)切除標(biāo)本中NF-кB與I-кB的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，探討NF-кB和I-кB在大腸癌中的表達(dá)特點(diǎn)、相互關(guān)系以及與大腸癌進(jìn)展的相關(guān)性，試圖為大腸癌的臨床治療以及判斷預(yù)后提供有價(jià)值的參考指標(biāo)。 方法： 1 標(biāo)本：選取河北醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)院外二科2005年3～7月間住院行

5、外科手術(shù)治療的大腸癌患者48例，分別取其腫瘤組織與相應(yīng)正常組織，正常組織距腫瘤邊緣至少10厘米。所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。 2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定NF-кB：將選取的組織制備成單細(xì)胞懸液，分別用兔抗人NF-кB多克隆抗體和羊抗兔FITC-IgG二抗進(jìn)行熒光標(biāo)記，采用Epics-XLII型流式細(xì)胞儀，對(duì)NF-кB蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。 3 免疫組化染色：采用ABC法，按試劑盒說明進(jìn)行操作。 4 NF-кB及I-кB的W

6、estern blot分析：取150μg正常與大腸癌組織提取物蛋白樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將印跡膜置于封閉液中封閉，隨后與一抗(兔抗人NF-кB及I-кB多克隆抗體)及二抗反應(yīng)。用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。 結(jié)果： 1 對(duì)流式細(xì)胞結(jié)果進(jìn)行分析證實(shí)，正常及大腸癌組織中均可檢測(cè)到NF-кB的表達(dá)，大腸癌組織中NF-кB明顯高于正常組織，差異具有顯著性(P<0.01)；侵及漿膜或周

7、圍軟組織的大腸癌組織中NF-к3顯著高于侵及肌層者(p<0.05)；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中NF-кB明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；隨著腫瘤Dukes分期的進(jìn)展，NF-кB的水平呈逐漸升高趨勢(shì)。 2 NF-кB的Western blot分析：大腸癌組織中NF-кB的表達(dá)量明顯高于正常組織(p<0.01)；侵及漿膜或周圍軟組織的大腸癌組織中NF.KB的表達(dá)量明顯高于侵及肌層者(P<0.01)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中

8、NF-кB的表達(dá)量明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。分化程度低的大腸癌組織中NF-кB的表達(dá)量明顯高于分化程度高者(P<0.01)。隨著腫瘤Dukes分期的進(jìn)展，NF-кB的表達(dá)量逐漸升高。 I-кB的Western blot分析：(1)大腸癌組織中I-кB的表達(dá)量明顯低于正常組織(P<0.01.)；侵及漿膜或周圍軟組織的大腸癌組織中I-кB的表達(dá)量低于侵及肌層者，但差異無顯著性(P>0.05)；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中

9、I-кB的表達(dá)量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異無顯著性(P>0.05)。分化程度低的大腸癌組織中I-кB的表達(dá)量明顯低于分化程度高者(P<0.05)。隨著腫瘤Dukes分期的進(jìn)展，I-кB的表達(dá)量逐漸降低。(2)大腸癌組織中磷酸化I-кB的表達(dá)量明顯高于正常組織(P<0.01)；侵及漿膜或周圍軟組織的大腸癌組織中磷酸化I-кB的表達(dá)量高于侵及肌層者，但差異無顯著性(P>0.05)；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中磷酸化I-кB的表達(dá)量高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

10、移者，差異無顯著性(P>0.05)。隨著腫瘤Dukes分期的進(jìn)展，磷酸化I-кB的表達(dá)量逐漸升高。 3 免疫組化：大腸癌組織中NF-кB的陽性染色顆粒明顯多于正常組織，大腸癌組織中I-кB的陽性顆粒明顯低于正常組織，且與腫瘤分化程度及侵襲性相關(guān)。以上結(jié)果與流式細(xì)胞和Western blot分析結(jié)果相一致。NF-кB的陽性表達(dá)顆粒主要分布在腫瘤細(xì)胞的胞漿中，細(xì)胞核也有分布。I-кB多表達(dá)于胞漿。 結(jié)論： 1 大腸癌

11、組織中NF-кB的活性和表達(dá)量明顯高于正常組織，并且隨著腫瘤侵犯深度的加深、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移以及Dukes分期的進(jìn)展而升高，提示NF-кB在大腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用。 2 大腸癌組織中I-кB的活性與表達(dá)量明顯低于正常組織。磷酸化I-кB的活性與表達(dá)量明顯高于正常組織，提示I-кB的降解和磷酸化可能有助于大腸癌的進(jìn)展。大腸癌分化程度低者I-кB的表達(dá)量低于分化程度高者，提示I-кB水平可能影響大腸癌的預(yù)后。