NF-κB通路在神經(jīng)母細(xì)胞瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：NF-κB通路是介導(dǎo)炎癥和腫瘤的重要通路，通過(guò)干預(yù)NF-κ B通路可以對(duì)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)行臨床干預(yù)。本課題以自主建立的有骨髓轉(zhuǎn)移的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(QDDQ-NM1)為對(duì)象，初步探討NF-κB通路在神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用及其機(jī)制，進(jìn)一步尋找NF-κB通路中的作用靶點(diǎn)，利用靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)特異性結(jié)合藥物，治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤，為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供新途徑。
　　 方法：應(yīng)用自主建立的國(guó)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系QDDQ-NM，利用N

2、F-κB通路特異性激活劑、抑制劑對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行干預(yù)。NF-κB通路特異性激活劑腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行干預(yù)（該組細(xì)胞為Ⅰ組），使NF-κB通路達(dá)到理論上的最大程度激活;空白對(duì)照組（Ⅱ組），利用同等量的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，和不同干預(yù)的細(xì)胞組進(jìn)行比較。NF-κB通路特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(Pyrrolidinedithiocarbamic acid, ammonium sa

3、lt，PDTC)對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行干預(yù)（該組細(xì)胞為Ⅲ組），使NF-κB通路達(dá)到理論上的最大程度抑制。各組細(xì)胞均置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。應(yīng)用半定量RT-PCR檢測(cè)不同干預(yù)措施細(xì)胞P65mRNA、CXCR4mRNA的表達(dá)。利用凝膠圖像掃描儀條帶灰度分析各組細(xì)胞P65mRNA、CXCR4mRNA的相對(duì)表達(dá)，從而分析P65mRNA、CXCR4mRNA在各組細(xì)胞中的表達(dá)變化，證實(shí)他們之間的聯(lián)系;應(yīng)用Western-blot蛋白印跡法檢

4、測(cè)不同干預(yù)措施細(xì)胞P65蛋白、CXCR4蛋白的相對(duì)表達(dá)，應(yīng)用Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值，得出各組P65蛋白、CXCR4蛋白相對(duì)表達(dá)，從而分析P65蛋白、CXCR4蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)變化，證實(shí)他們之間的聯(lián)系。Transwell小室是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移侵襲能力的經(jīng)典方法，利用Transwell小室檢測(cè)不同干預(yù)措施細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力。在相同培養(yǎng)條件下通過(guò)觀察各組細(xì)胞穿過(guò)ECM膠的細(xì)胞數(shù)來(lái)表示瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力，穿過(guò)

5、ECM膠的細(xì)胞數(shù)目多，表示瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力強(qiáng);反之，則侵襲轉(zhuǎn)移能力弱。進(jìn)而分析各組細(xì)胞干預(yù)的效果。
　　 結(jié)果：RT-PCR結(jié)果示Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組，其P65 mRNA相對(duì)含量分別為0.7211±0.2233;0.6002±0.1822和0.5553±0.0904即在各組細(xì)胞中都有P65 mRNA表達(dá)，且Ⅰ組高于Ⅱ組，Ⅱ組高于Ⅲ組，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CXCR4 mRNA相對(duì)表達(dá)含量分別為0.4128±0

6、.0176;0.3045±0.1910和0.1829±0.0091即在各組細(xì)胞中都有CXCR4mRNA表達(dá)，且Ⅰ組高于Ⅱ組，Ⅱ組高于Ⅲ組，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果表明，Ⅰ組細(xì)胞在NF-κB通路最大程度激活時(shí)其NF-κ B蛋白P65的mRNA高表達(dá)，其下游調(diào)節(jié)蛋白CXCR4mRNA也處于高表達(dá)狀態(tài);Ⅲ組細(xì)胞是在NF-κB通路抑制狀態(tài)下，其NF-κB蛋白P65的mRNA表達(dá)明顯較少，其下游調(diào)節(jié)蛋白CXCR4m

7、RNA也處于低表達(dá)狀態(tài)。與空白對(duì)照組細(xì)胞比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western結(jié)果示Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組蛋白相對(duì)灰度值分別為:P65蛋白，0.9026±0.0375;0.8340±0.0379;0.8007±0.0793; CXCR4蛋白，0.9472±0.0193;0.9091±0.0216;0.6025±0.0384。各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Western結(jié)果表明，Ⅰ組細(xì)胞在NF-κB通路最大程度激活時(shí)其NF-κB蛋白P65

8、高表達(dá)，其下游調(diào)節(jié)蛋白CXCR4也處于高表達(dá)狀態(tài);Ⅲ組細(xì)胞是在NF-κ B通路抑制狀態(tài)下，其NF-κB蛋白P65表達(dá)明顯較少，其下游調(diào)節(jié)蛋白CXCR4也處于低表達(dá)狀態(tài)。與空白對(duì)照組細(xì)胞比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Transwell小室檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲力實(shí)驗(yàn)顯示Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組細(xì)胞穿過(guò)ECM基質(zhì)的細(xì)胞數(shù)分別為:55.8000±2.7749;46.6000±5.9414;30.2000±7.4967。各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Tran

9、swell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅰ組細(xì)胞在NF-κB通路最大程度激活時(shí)，細(xì)胞穿過(guò)ECM膠的數(shù)目最多;Ⅲ組細(xì)胞是在NF-κB通路抑制狀態(tài)下，細(xì)胞穿過(guò)ECM膠的數(shù)目最少。且與空白對(duì)照組細(xì)胞比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明NF-κB通路能促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　 結(jié)論：神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(QDDQ-NM1)細(xì)胞在NF-κ B通路不同狀態(tài)下其P65mRNA的表達(dá)與其下游基因CXCR4mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)。神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(QDDQ