EMT及其相關(guān)因素與大腸癌轉(zhuǎn)移關(guān)系的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　 大腸癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康,其發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)移是癌癥治療中的難點(diǎn),乃患者死亡的主要因?yàn)?因此探討大腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,尋找有效的預(yù)防和治療途徑是大腸癌研究的重要內(nèi)容。
　　 上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化態(tài)(epithelial-mesenchymal transition,EMT),是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象,目前EMT被看成導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展的病理過(guò)程

2、,與侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)系。在EMT的過(guò)程中,細(xì)胞之間的粘附減少,上皮細(xì)胞極性喪失,與周?chē)|(zhì)細(xì)胞的接觸減少,細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng),同時(shí)細(xì)胞表型發(fā)生改變,喪失上皮表型,如角蛋白絲,E-鈣粘素(E-cadherin),而獲得間質(zhì)表型,如波形蛋白(Vimentin),纖維連接蛋白,N-鈣粘素,α-SMA等。其中E-cadherin水平的下降可以導(dǎo)致細(xì)胞的粘附力降低,使細(xì)胞獲得易于侵襲和轉(zhuǎn)移的特性,E-cadherin表達(dá)的丟失已經(jīng)被認(rèn)為是EMT

3、最顯著的特征。目前認(rèn)為EMT的發(fā)生過(guò)程是由精確的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制調(diào)控,由微環(huán)境因子作用于細(xì)胞表面特異性受體,將信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),誘導(dǎo)細(xì)胞通路的改變,最終導(dǎo)致基因表達(dá)的改變。
　　 Tiaml基因(T lymphoma invasion and metastasis)是從鼠T淋巴瘤中克隆出來(lái)的基因,全稱(chēng)T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1。Tiaml幾乎在所有的腫瘤細(xì)胞中都表達(dá),但表達(dá)水平根據(jù)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的不同而不同。其在肺癌、乳腺

4、癌、卵巢癌、喉癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤組織中呈陽(yáng)性表達(dá)并與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Tiaml對(duì)于控制細(xì)胞形態(tài)、粘附和運(yùn)動(dòng)以及信號(hào)傳導(dǎo)都有重要作用,并能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　 文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)腸癌中高表達(dá)Tiaml的細(xì)胞也高表達(dá)Vimentin,具有更多的轉(zhuǎn)移表型,同時(shí)E-cadherin的表達(dá)減少。本課題組前期通過(guò)免疫組化檢測(cè)大腸癌組織中Tiaml與EMT標(biāo)志物的表達(dá),顯示Tiaml的表達(dá)與上皮表型標(biāo)志物E-cadherin、CK

5、呈正相關(guān),而與間質(zhì)標(biāo)志Vimentin呈負(fù)相關(guān)。證實(shí)Tiaml與大腸癌的分化和轉(zhuǎn)移有關(guān),其促進(jìn)大腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與EMT發(fā)生有關(guān)。并且發(fā)現(xiàn)Tiaml基因表達(dá)沉默可逆轉(zhuǎn)Lovo細(xì)胞的EMT表型,同時(shí)其侵襲轉(zhuǎn)移的能力減弱。那么對(duì)于不同轉(zhuǎn)移能力的大腸癌細(xì)胞,Tiaml與EMT標(biāo)記物的表達(dá)情況怎樣?兩者又有何關(guān)系?將在本研究中探討。
　　 TGF-β1是一種具有多種生物學(xué)活性的多肽生長(zhǎng)因子,可影響腫瘤細(xì)胞的形態(tài),改變其運(yùn)動(dòng)及侵襲能力,

6、并能誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT,此過(guò)程由諸多細(xì)胞因子和蛋白一起參與,共同調(diào)節(jié)。MMP-2的主要作用是降解細(xì)胞外基質(zhì),與腫瘤EMT的發(fā)生密切相關(guān),影響腫瘤細(xì)胞的增值和遷移等行為。由此可見(jiàn)Tiaml、TGF-β1和MMP-2促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移都與EMT的發(fā)生有關(guān),那么它們之間是否有關(guān)聯(lián)?需進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　 近年有文獻(xiàn)報(bào)道EMT與非EMT細(xì)胞是共同完成自發(fā)轉(zhuǎn)移的過(guò)程,EMT細(xì)胞通過(guò)降解細(xì)胞周?chē)|(zhì)和血管壁,為非EMT細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移鋪

7、平道路。此觀(guān)點(diǎn)與以往認(rèn)為的發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞,其遷移能力比非EMT細(xì)胞強(qiáng)有不同之處。那么在大腸癌中發(fā)生EMT的細(xì)胞和非EMT細(xì)胞之間是否也存在這樣的協(xié)同關(guān)系呢?
　　 本研究將重點(diǎn)從以上三個(gè)方面探討EMT及其相關(guān)因素Tiaml、TGF-β1和MMP-2與大腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系,初步探討EMT及非EMT的細(xì)胞在大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 目的：
　　 1、檢測(cè)不同轉(zhuǎn)移能力的大腸癌細(xì)胞系中Tiaml與EMT標(biāo)記物的表

8、達(dá)并分析兩者之間的關(guān)系。
　　 2、探討Tiaml、TGF-β1和MMP-2在大腸癌EMT中的關(guān)系。
　　 3、探討EMT及非EMT的細(xì)胞在大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 方法
　　 1、用Real time-RT PCR法分析Tiaml mRNA,E-cadherin mRNA和VimentinmRNA在6種大腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況；通過(guò)免疫組化檢測(cè)Tiaml,E-cadherin和Vimentin在L

9、oVo和HT29中的表達(dá)；通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色觀(guān)察LoVo和HT29的細(xì)胞骨架。
　　 2、免疫組化檢測(cè):應(yīng)用免疫組化二步法,檢測(cè)23例大腸正常組織、85例大腸癌和28例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中TGF-β1和MMP-2的表達(dá),結(jié)合本課題組前期實(shí)驗(yàn)Tiaml和E-cadherin在人大腸癌組織中表達(dá)的結(jié)果,探討Tiaml與TGF-β1,MMP-2在大腸癌EMT中的關(guān)系。
　　 3、使用TGF-β1長(zhǎng)期誘導(dǎo)大腸癌HT29細(xì)胞；應(yīng)用熒光定

10、量PCR檢測(cè)誘導(dǎo)前后細(xì)胞的Tiaml mRNA、E-cadherin mRNA和Vimentin mRNA的表達(dá)；HE染色觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)；考馬斯亮藍(lán)染色觀(guān)察細(xì)胞骨架；劃痕實(shí)驗(yàn)觀(guān)察刺激前、刺激后及兩者混合培養(yǎng)后細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)情況。將綠色和紅色熒光蛋白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染發(fā)生EMT的HT29/TGF-β1和非EMT的HT29細(xì)胞,使之分別標(biāo)記上綠光和紅光,兩者混合培養(yǎng),進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn),觀(guān)察兩種細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)情況。
　　 結(jié)論
　　 1、部分