跨膜4超家族成員9與大腸癌轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究.pdf

1、本研究試圖用基因芯片技術(shù)篩選三株具有不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細(xì)胞株的差異表達(dá)基因，從中挑選出有可能影響腫瘤轉(zhuǎn)移的基因作為研究對(duì)象，從分子和細(xì)胞水平深入探討該基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，旨在研究對(duì)大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，不僅有利于闡明大腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，而且還能為臨床上預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移、基因治療和預(yù)后判斷尋找新的有效靶點(diǎn)。 一、基因芯片技術(shù)篩選三株具不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細(xì)胞株的差異表達(dá)基因，確定研究目的基因，驗(yàn)證基因芯片檢查結(jié)果 1

2、、確定三個(gè)細(xì)胞株轉(zhuǎn)移能力的差異用異質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)和趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)確定LST、SW480和Lovo三個(gè)細(xì)胞株之間轉(zhuǎn)移能力的差異。 2、基因芯片以一對(duì)樣本的信號(hào)平均值＞2或個(gè)＜2而另個(gè)＞10；信號(hào)值變異系數(shù)＜0.33；信號(hào)平均值有2倍以上表達(dá)差異作為判定基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)。在明顯表達(dá)上調(diào)的基因中與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因有：發(fā)動(dòng)蛋白2、ADP-核糖基化因子1。在明顯下調(diào)表達(dá)的基因中，與轉(zhuǎn)移有關(guān)系的有跨膜4超家族成員9，又稱(chēng)四分子交聯(lián)體5。TM4SF

3、9在結(jié)腸癌中的表達(dá)，為本研究首次報(bào)道，選擇該基因作為研究對(duì)象。 3、基因水平驗(yàn)證基因芯片結(jié)果用半定量RT-PCR技術(shù)，結(jié)果顯示TM4SF9mRNA在三個(gè)細(xì)胞株中的表達(dá)水平差異與基因芯片檢測(cè)結(jié)果相符。 4、蛋白水平驗(yàn)證基因芯片結(jié)果細(xì)胞免疫組化技術(shù)定性，免疫印跡技術(shù)、免疫熒光技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)定量研究。結(jié)果顯示TM4SF9蛋白表達(dá)水平差異與基因芯片檢測(cè)結(jié)果相符。 5、組織定位研究：臨床結(jié)腸癌及癌旁正常組織免疫組化

4、研究表明，TM4SF9定位在結(jié)腸粘膜細(xì)胞的細(xì)胞膜上，結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)明顯強(qiáng)于正常結(jié)腸粘膜細(xì)胞。 二、體外實(shí)驗(yàn)觀察改變TM4SF9表達(dá)水平對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)行為的影響 1、克隆Lovo細(xì)胞TM4SF9基因，轉(zhuǎn)染LST細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建TM4SF9.pEGFP-C1重組質(zhì)粒，用Lipofectamine2000TM.轉(zhuǎn)染入LST細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1質(zhì)粒做對(duì)照。 2、RNAi下調(diào)Lovo細(xì)胞

5、TM4SF9表達(dá)設(shè)計(jì)siRNA片段，用化學(xué)合成法合成，用Lipofectamine2000TM導(dǎo)入Lovo細(xì)胞中，干擾TM4SF9表達(dá)。流式細(xì)胞儀及免疫蛋白印跡檢測(cè)證明干擾成功，Lovo細(xì)胞TM4SF9蛋白表達(dá)水平明顯下降。 3、異質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：改變TM4SF9表達(dá)水平后，細(xì)胞粘附能力發(fā)生改變，上調(diào)TM4SF9表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞異質(zhì)粘附性，下調(diào)TM4SF9表達(dá)則降低細(xì)胞的異質(zhì)粘附性。 4、趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，

6、改變TM4SF9表達(dá)水平對(duì)結(jié)腸癌對(duì)運(yùn)動(dòng)性影響無(wú)顯著性意義。 結(jié)論： 1、LST、SW480及Lovo細(xì)胞株具有不同轉(zhuǎn)移潛能，Lovo＞SW480＞LST。 2、LST、SW480、Lovo細(xì)胞TM4SF9表達(dá)水平有差異，Lovo＞SW480＞LST。 3、TM4SF9在結(jié)腸粘膜細(xì)胞膜上有表達(dá)，與正常結(jié)腸粘膜細(xì)胞相比，結(jié)腸癌細(xì)胞TM4SF9表達(dá)明顯增強(qiáng)； 4、改變TM4SF9表達(dá)水平可以改變結(jié)腸癌細(xì)