人破骨細胞抑制性凝集素胞外段在大腸桿菌中的表達和生物活性分析.pdf

1、破骨細胞抑制性凝集素(Osteoclasstinhibitorylectin，OCIL)是由成骨細胞系/基質(zhì)細胞譜系表達的Ⅱ型跨膜蛋白，屬于C-類凝集素，具有抑制破骨細胞分化和成熟的功能?，F(xiàn)在對OCIL的研究剛剛開始，對它受體及其下游的信號傳導通路和它的生物學功能還了解甚少。我們通過基因工程的研究方法，制備得到重組的OCIL活性蛋白，為后續(xù)的實驗研究打下良好的基礎(chǔ)。 OCIL蛋白分為胞內(nèi)段、胞外段和跨膜區(qū)三個部分，胞外段含有C-

2、類凝集素的基序，是抑制破骨細胞形成的活性區(qū)域。基于此，我們應用基因工程的方法，在大腸桿菌中表達OCIL胞外段重組蛋白，觀察重組蛋白對骨髓破骨細胞的形成的影響。 由于異源基因在原核系統(tǒng)中表達時，原核系統(tǒng)在翻譯過程對密碼子的選擇有偏嗜性，基于此，我們按照大腸桿菌密碼子偏嗜性和簡并性原則，修改OCIL胞外段編碼序列的堿基序列，但是不改變OCIL的蛋白序列組成，通過重組PCR的方法得到連續(xù)、完整的OCIL胞外域DNA片段。借助克隆載體的

3、中介，目的片段連接于表達載體pMAL-c2x，轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)plysS表達宿主菌。重組質(zhì)粒在37℃、0.5mMIPTG誘導表達4小時，制備細胞抽提物，可溶部分和沉淀部分分別行SDS-PAGE，觀察到細胞裂解物上清和沉淀在預期分子量位置均有明顯的蛋白表達條帶。免疫印記Western-blotting顯示預期位置蛋白可與抗MBP抗體發(fā)生特異性免疫反應，證明此重組蛋白確系MBP-OCIL重組融合蛋白。改變表達目的蛋白的溫度、時間和誘

4、導劑的濃度，優(yōu)化目的蛋白表達的條件，獲得最適的表達條件：表達溫度30℃，表達時間12小時，誘導劑IPTG的濃度為0.3mM。利用融合蛋白中的擔體蛋白MBP可以與直鏈淀粉形成氫鍵的特點，使用直鏈淀粉親和層析柱，從BL21(DE3)plysS宿主菌表達的細胞裂解物上清中分離得到重組融合蛋白。通過透析的方法除去洗脫液中的洗脫劑麥芽糖、一些鹽離子和EDTA。BCA法測得透析液總蛋白濃度，透析液行SDS-PAGE還原凝膠電泳，UVP凝膠分析系統(tǒng)分

5、析純化后融合蛋白的純度。體外培養(yǎng)小鼠股骨骨髓細胞，在M-CSF和RANKL刺激骨髓細胞向破骨細胞分化的基礎(chǔ)上，加入不同濃度的重組融合蛋白MBP-OCIL，觀察重組MBP-OCIL對破骨細胞的抑制作用，抗酒石酸酸性磷酸酶染色，顯微鏡下計數(shù)抗酒石酸酸性磷酸酶染色陽性細胞細胞數(shù)。結(jié)果顯示我們所制備的重組融合蛋白MBP-OCIL對小鼠破骨細胞的形成有明顯的抑制作用(p＜0.05)，并且隨著慢MBP-OCIL濃度的增加，破骨細胞細胞數(shù)減少，MBP