rhBMP-6在大腸桿菌中可溶表達(dá)、純化及活性分析.pdf

1、中文摘要rhBMP6在大腸桿菌中可溶表達(dá)、純化及活性分析中文摘要BMP6是BMPs家族中的一員，是一種調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化的骨誘導(dǎo)因子。在臨床上主要應(yīng)用于脊柱融合、長(zhǎng)骨缺損、選擇性骨折的修復(fù)。有誘骨活性的BMP6是多二硫鍵的二聚體，疏水性極強(qiáng)容易聚集沉淀。本研究目的是采用基因工程的方法，在大腸桿菌中可溶表達(dá)具有生物活性的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋i6(rhBMP6)。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET15bBMP6，pGEX5XB

2、MP6基礎(chǔ)上，通過SDSPAGE、親和層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、WesternBlot、堿性磷酸酶活性分析等生物學(xué)技術(shù)與方法，篩選出能可溶表達(dá)有活性的rhBMP6的表達(dá)載體和宿主菌，優(yōu)化培養(yǎng)條件，并對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化和誘骨活性分析?，F(xiàn)將已完成的工作報(bào)告如下:1rhBMP‘幾種融合表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)比較構(gòu)建了具有MBP.TRX.CBD融合標(biāo)簽的rhBMP6成熟肚的原核表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌后誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，調(diào)整誘導(dǎo)溫度和I

3、PTG濃度，分析誘導(dǎo)條件的改變對(duì)蛋白表達(dá)量和溶解性的影響。結(jié)果表明，MBP能夠有效的提高rhBMP6的溶解性，誘導(dǎo)產(chǎn)生的融合蛋白量約占菌體總蛋白30%以上，而且可溶的蛋白占誘導(dǎo)蛋白的80%左右誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度的降低對(duì)蛋白溶解性影響不大。2、rhBMP6單體的純化和生物活性的檢鍘MBPBMP6融合蛋白經(jīng)Amylose柱親和純化，Superdex7510300GL凝膠排阻層析后達(dá)到了電泳純?nèi)诤系鞍?。FactorXa酶切后，再經(jīng)DEAE

4、SepharoseFastFlow陰離子交換層析得到純度達(dá)95%以上的單體rhBMP6蛋白。SDSPAGE.WestemBlot以及FactorXa酶切鑒定rhBMP6的正確表達(dá)。對(duì)純化獲得的rhBMP6單體進(jìn)行堿性磷酸酶的活性測(cè)定，結(jié)果證實(shí)了:rhBMP6單體不具有誘導(dǎo)骨形成的生物活性。AbstractBonemorphogeneticprotein6(BMP6)amemberoftheBMPsfamilyisapotentprote

5、inforfuturetreatmentstrategiesofboneregenerationasitisaveryimportantregulatorofbonehomeostasis.ActiveBMP6isadimercontainingmultidisulfidebondsandisahighlyhydrophobicproteinpronetoaggregation.ToobtainsolubleandactiveBMP6i

6、nEscherichiacoliweusemolecularbiologytechnologysuchasSDSPAGEWesternBlotaffinitypurificationgelfiltrationchromatographyandalkalinephosphataseactivityassaytoscreenoutasuitableexpressionsystemwheretheproteinisproducedinasol

7、ubleandcorrectlyfoldedconformationinhighyields.1.WeconstructedsixexpressionvectorsandcomparedtheeffectsoffourNterminalfusiontag(TRXGSTMBPandCBD)andNterminalHisbtag.Wetestedtheexpressionandsolubilityunderthedifferentcondi

8、tions(expressionhoststemperaturesandinductorconcentrations).Aseriesofexperimentsledtothefindingthattheplacementofmaltosebindingprotein(MBP)beforetheBMP6wasbestinavailingthesolubleexpressionoftheprotein.Theamountoffusionp

9、roteinexpressedfromthepMALc2XBMP6wasabout30%ofthetotalcelularprotein，andtherewasmorethan80%ofMBPBMP6inthesolublefractionofthecelextracts.Thedecreaseofinductiontemperaturesfrom370Cto2G0CandIPTGconcentrationswerenotpronoun

10、cedinimprovingsolubility.2MBPBMP6waspurifiedbyamylaseaffinitycolumnchromatographyandsuperdex7510300GLchromatography.58kDaMBPBMP6wasconfirmedbyWesternblotingassayandcouldbecleavedbyFactorXaproteasetoyield42kDaMBPand16kDaB

11、MP6.BMP6wasfinallypurifiedbyDEAESepharoseFastFlowionexchangechromatography.ThebiologicalactivitywastestedbytheinductionofalkalinephosphataseactivityinC2C12cells.BMP6monomerdidnotshowanybiologicalactivity.3Wealsofoundthat