抗偏頭痛中藥安天膠囊的研究和開發(fā)及天然植物中活性成分的分離和研究.pdf

1、頭痛是一種常見疾病，隨著現代生活節(jié)奏的加快，人群中頭痛的發(fā)病率呈上升的趨勢，嚴重影響患者的生活質量和工作。頭痛發(fā)病機制復雜，其作用機制尚不十分清楚。目前，國內外臨床治療頭痛主要用解熱鎮(zhèn)痛藥、麥角生物堿、非甾體抗炎藥和5-HT 受體激動劑對癥治療，并輔以中樞鎮(zhèn)靜藥緩解病情。中草藥在我國醫(yī)療保健中已有數千年的應用歷史，中藥安天的開發(fā)源于《太平圣惠方》，由旋覆花和牛蒡子兩味中草藥組成的處方。此兩種中藥的總提物經扭體藥理試驗均表現出顯著的鎮(zhèn)痛活

2、性。本課題采用現代化的手段，著眼于中藥有效成分的研究與開發(fā)，發(fā)掘傳統中藥的精華。 菊科植物旋覆花為我國藥典收載的藥用植物，作為常用中藥，具有降氣、消痰，行水，止嘔的功效。旋復花屬植物含有甾醇、倍半萜、香豆素、及類黃酮等化學成分，這些成分的生物活性研究表明旋覆花主要用于治療支氣管炎、肝炎、關節(jié)炎和抗腫瘤等。其中對倍半萜內酯化合物抗腫瘤及抗炎活性研究報道較多，但未見有關旋覆花治療頭痛及鎮(zhèn)痛作用活性成分的報道。歐亞旋覆花廣泛分布在我國

3、東北、內蒙古、新疆等地，但尚未見歐亞旋覆花作為旋覆花藥材使用的先例。歐亞旋覆花乙醇提取物，經扭體、熱板、甩尾和福爾馬林舔足藥理試驗均證明本品總提取物有鎮(zhèn)痛作用，低劑量抑制炎性疼痛，高劑量既抑制炎性疼痛又抑制神經疼痛。這是迄今為止第一次發(fā)現此草藥中具有鎮(zhèn)痛作用。 本研究采用系統提取分離手段，建立了歐亞旋覆花多糖的提取制備及含量測定方法；制備了該藥材揮發(fā)油并對其成分進行了GC-MS分析；分離、制備并確定了該草藥的鎮(zhèn)痛活性部位及有效成

4、分，為研究并發(fā)現新化學結構類型的鎮(zhèn)痛藥物以及今后對這一草藥的研究性開發(fā)提供實驗依據。 攻克癌癥是21世紀醫(yī)學研究的主要目標之一，而目前臨床采用的絕大多數抗腫瘤藥物為化學合成品。用于抗腫瘤治療的天然產物及其半合成代用品雖然為數不多，但一直是抗腫瘤藥物研究和開發(fā)的熱點。紫杉醇是當今臨床最好的治療卵巢癌的藥物，自1992年美國FDA批準上市用于卵巢癌和乳腺癌的治療后，其應用范圍現擴展到皮膚、肺、腦和頸部等惡性腫瘤。阻礙紫杉醇臨床抗腫瘤

5、應用的主要障礙是天然來源匱乏。紫杉醇在紅豆杉樹木中的含量很低，收率也僅有0.006～0.007％。為此，保護藥用資源，避免耗竭，研究、尋找其天然或半合成代用品是該領域的重點之一。日本紅豆杉(Taxus cuspidata)的研究始于二十世紀六十年代，已有超過200個倍半萜類紫杉烷成分發(fā)現并報道，其中包括紫杉醇和紫杉醇半合成原料10—DAB。1992年在加拿大紅豆杉(Taxus canadenes)針葉中發(fā)現一紫杉烷成分的化學結構與紫杉醇

6、的骨架結構近似，并以此化學成分為原料合成了紫杉醇。在加拿大魁北克省也生長著常青灌木日本紅豆杉。 本研究對加拿大產日本紅豆杉針葉的紫杉烷成分進行了研究，分析其作為紫杉醇類抗腫瘤藥新天然來源的可行性。 第一部分抗偏頭痛中藥安天膠囊的制備工藝研究 目的：在已有的藥理活性研究基礎上，建立安天膠囊劑制備工藝，克服水煎劑的劑量標準不明確，服用、攜帶不便等缺點。 方法：(1)提取方法：歐亞旋覆花醇提水沉；牛蒡子水提醇沉

7、。濾液合并，制粉裝膠囊。(2)工藝條件優(yōu)化：采用正交試驗，以浸膏得率、有效成分含量及扭體抑制率等為指標，考察提取溶劑、提取時間和次數等關鍵因素。(3)優(yōu)選的制備工藝經中試放大，驗證工業(yè)化生產的可行性。 結果：旋覆花提取工藝為10倍量95％乙醇提取三次，每次一個小時，醇提液濃縮后，水沉除雜。牛蒡子提取工藝為10倍量水提取三次，每次一個小時，濃縮水提液用90％乙醇醇沉除雜，濾液合并干燥制粉裝膠囊。 結論：本研究在傳統中藥湯劑

8、的基礎之上，通過合理的實驗設計對新中藥制劑的制備工藝進行了篩選和優(yōu)化。采用有效成分和藥理學試驗雙重控制因子，對生產工藝立體監(jiān)控，改進了傳統古方的提取方法，創(chuàng)新性采用不同方法，分別提取的新工藝，用現代化定量檢測手段規(guī)范中藥的制備，改善了中藥湯劑的不穩(wěn)定和盲目性，實現了中藥的標準化生產。通過正交試驗優(yōu)選出安天膠囊劑的制備工藝，安全有效且穩(wěn)定性好，成本低廉，已報批國家中藥新藥。 第二部分歐亞旋覆花中多糖、揮發(fā)油、及倍半萜類活性化合物的

9、研究 目的：本研究旨在通過制備歐亞旋覆花多糖、揮發(fā)油、鎮(zhèn)痛活性部位和倍半萜類活性化合物，建立多糖的制備和含量測定方法；在制備分離揮發(fā)油的基礎上，用GC-MS對山西運城地區(qū)產歐亞旋覆花揮發(fā)油進行化學成分分析和鑒定；采用先進的提取分離技術和波譜學鑒定手段，結合鎮(zhèn)痛藥理試驗模型，分離并確定鎮(zhèn)痛活性部位及成分，為添補這一草藥藥學研究上的空白和全方位研究并開發(fā)這一古老藥用資源奠定實驗基礎。 方法：(1)歐亞旋覆花多糖：95％乙醇脫

10、脂后，干燥植物用水提取兩次，濾液濃縮后，取上清液加無水乙醇沉淀，沉淀物經過濾、洗滌、干燥后得歐亞旋覆花多糖，運用苯酚—硫酸法測定其含量。(2)揮發(fā)油：采用水蒸氣蒸餾法從歐亞旋覆花中提取揮發(fā)油，用歸一化法測定成分含量。經過質譜計算機數據系統檢索，確定出歐亞旋覆花揮發(fā)油中的化學成分。色譜條件：DB．5石英毛細管色譜柱(30m×0.25mm，膜厚0.25gm)；柱溫：70℃(保持2min)，以10℃/min升到230℃(保持10min)；進樣

11、口溫度250℃；分流比15：1；載氣(He)流速為1.0ml/min。(3)鎮(zhèn)痛活性部位：干燥的歐亞旋覆花地上部分，用95％乙醇浸提4次，每次2天，濾液減壓濃縮，將醇提物懸浮于水中，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取物經干燥后，經小鼠醋酸扭體實驗確定鎮(zhèn)痛活性部位。(4)倍半萜類活性化合物：具有鎮(zhèn)痛活性的氯仿部分經閃式柱層析和加壓柱層析分離制備倍半萜類活性成分，產品化學結構用波譜學方法檢測鑒定。 結論：本文首次研究了歐亞旋

12、覆花總多糖和揮發(fā)油的制備及分析方法，乙醇—水提取多糖效果較好，苯酚—硫酸法含量測定方法可行。水蒸氣蒸餾法制備揮發(fā)油，方法穩(wěn)定可靠，重現性好，適于歐亞旋覆花揮發(fā)油化學成分分析，上述產品的生物活性有待今后進一步研究。本文首次報道了歐亞旋覆花的鎮(zhèn)痛活性，并深入研究和確定了鎮(zhèn)痛活性部位及活性成分，即氯仿部分和1-氧-乙酰大花旋覆花內酯。采用色譜分離技術，以該山西產歐亞旋覆花地上部分為原料建立了該成分作為化學對照品的提取、分離、精制的制備方法，分

13、離制備的1-氧-乙酰大花旋覆花內酯已用于旋覆花新的質量標準研究。作為鎮(zhèn)痛活性有效成分該化合物有關抗炎作用的分子生物學研究已發(fā)表在國際雜志上，其偏頭痛作用機制有待進一步深入研究。作為首次在歐亞旋覆花中發(fā)現治療頭痛及鎮(zhèn)痛作用活性物質，我們申報了苯并呋喃酮類(即倍半萜內酯類)及其衍生物鎮(zhèn)痛作用的國家專利(專利號ZL02117985.9)。 第三部分加拿大魁北克產日本紅豆杉針葉中紫杉烷化學成分的研究 目的：本研究以加拿大產日本紅

14、豆杉針葉為研究對象，采用先進的提取分離手段和新技術，對其針葉中紫杉烷化學成分進行系統分離和波譜學鑒定，并比較日本產紅豆杉針葉中紫杉烷成分的報道，尋找新的化合物并考察該植物作為新的紫杉醇藥用資源的可行性。 方法：生長在加拿大魁北克的日本紫杉干燥針葉經粉碎后，室溫下用甲醇浸提三次，每次24h，濾液合并濃縮后，浸膏懸浮于飽和鹽水中，先用正己烷脫脂，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，經干燥后，減壓回收溶劑。二氯甲烷部分的化學成分的分離采用反

15、復柱層析色譜和制備、半制備高效液相色譜等分離手段，薄層層析色譜、分析高效液相色譜和NMR波譜檢測手段，分離并鑒定紫杉烷化學成分。 結論：加拿大魁北克產日本紅豆杉的紫杉烷成分確實與日本紅豆杉存在一定差異，在已鑒定結構的紫杉烷中12個化合物是首次從日本紫杉中分離得到，它們是2—去乙酰氧基一紅豆杉素J(4)，9，10-deacetyltaxinine(8)，5-cinnamoyl-9，10-diacetyltaxicin Ⅰ(2-de

16、acetyltaxinine)(9)，yunnanxane(12)，5a-cinnamoyloxy-9α，10β，13α-triacetoxytaxa-4(20)，11-diene(13)，2，10-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin Ⅱ(14)，Taxine B(16)，10-deacetyltaxinine B(19)，20-cinnamoyloxy-5-epi-canadensene(22)，2α，

17、10β-diacetoxy-1β，9α-dihydroxy-5a-cinnamoyoxy-3，11-cyclotaxa-4(20)-dien-13-one (25)，1β，2α，9α，10β-tetrahydroxy-5a-cinnamoyoxytaxa-4(20)，11-dien-13-one(28)，7-epi-10-deacetyltaxol(29)。縮環(huán)taxinine A(7)為在日本紫杉中發(fā)現的化學不穩(wěn)定新型紫杉烷天然產物；