環(huán)氧化酶-2抑制劑對(duì)喉癌治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分喉癌組織中環(huán)氧化酶-2(Cox-2)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR研究 目的：測(cè)定環(huán)氧化酶-2(Cox-2)mRNA在喉鱗癌組織中的含量，并分析環(huán)氧化酶-2(Cox-2)mRNA與喉鱗癌臨床分期及組織分化程度的關(guān)系。 方法：用序列特異性引物和熒光染料SYBRGreenⅠ聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，檢測(cè)25例原發(fā)性喉鱗癌和癌旁組織中Cox-2mRNA表達(dá)，采用GAPDH作對(duì)照。 結(jié)果：25份標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熔解

2、曲線分析及DNA瓊脂糖凝膠電泳，證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物為Cox-2和GAPDH。Cox-2mRNA在喉鱗癌中的陽(yáng)性率是100％，而在癌旁組織為48％(25例中12例陽(yáng)性)，癌和癌旁組織的NCox分別為16.54±13.27、9.24±6.91，兩者之間差異有顯著性(t=2.438，P＜0.05)，且Cox-2mRNA在喉癌中的表達(dá)水平與其分化程度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)聯(lián)系，即臨床分期Ⅰ期與Ⅱ期，Ⅱ期與Ⅲ/Ⅳ期差異有顯著性。 結(jié)論：應(yīng)用熒光染料SYBR

3、GreenⅠ的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)能夠?qū)ox-2基因表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，Cox-2基因表達(dá)的上調(diào)與喉癌的發(fā)生有關(guān)，且可以作為一種有效的喉癌分子標(biāo)志。 第二部分兩種選擇性環(huán)氧化酶-2抑制劑對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用 目的：研究選擇性環(huán)氧化酶-2抑制劑Sc-58125和Celecoxib對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用并探討其作用機(jī)制。 方法：喉癌Hep-2細(xì)胞用含不同濃度Sc-58125和Cel

4、ecoxib培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，分別采用MTT法測(cè)定生長(zhǎng)抑制率，DNA瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率及細(xì)胞周期。 結(jié)果：經(jīng)顯微鏡觀察和MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Sc-58125和Celecoxib均可抑制Hep-2細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期結(jié)果顯示：隨著Sc-58125作用濃度的增加，處于G2/M期細(xì)胞數(shù)目增多；而隨著Celecoxib作用濃度的增加，處于G0/G1期細(xì)胞數(shù)目增多，當(dāng)濃度為50、1

5、00μmol/L時(shí)，出現(xiàn)明顯凋亡。DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示50、100μmol/LCelecoxib作用組出現(xiàn)DNA梯帶，而Sc-58125作用組沒有出現(xiàn)DNA梯帶。 結(jié)論：兩種選擇性環(huán)氧化酶-2抑制劑Sc-58125和Celecoxib均可抑制Hep-2細(xì)胞體外增殖，改變細(xì)胞周期分布；且高濃度的Celecoxib可誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡。 第三部分選擇性環(huán)氧化酶-2抑制劑Celecoxib體外誘導(dǎo)人類喉癌細(xì)胞

6、(Hep-2)凋亡的分子機(jī)制 目的：研究選擇性環(huán)氧化酶2抑制劑Celecoxib體外誘導(dǎo)人類喉癌細(xì)胞(Hep-2)凋亡的分子機(jī)制。 方法：經(jīng)流式細(xì)胞儀、實(shí)時(shí)定量RT-PCR、免疫組化以及Western印跡法分別檢測(cè)用100μmol/LCelecoxib培養(yǎng)液培養(yǎng)0、6、12和24h的喉癌Hep-2細(xì)胞中Cox-2、bcl-2基因表達(dá)水平及胞漿中Cox-2、細(xì)胞色素C和活性Caspase-3蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：①

7、經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)100μmol/LCelecoxib可誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞調(diào)亡，具有時(shí)間依賴性；②100μmol/LCelecoxib作用后，Hep-2細(xì)胞中Cox-2、bcl-2基因表達(dá)水平維持不變；③100μmol/LCelecoxib作用后，Hep-2細(xì)胞漿中Cox-2和bcl-2蛋白表達(dá)水平無(wú)任何改變；細(xì)胞色素C和活性Caspase-3蛋白表達(dá)水平逐漸增加，具有時(shí)間依賴性。 結(jié)論：①100μmol/LCelecoxib

8、可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人類喉癌細(xì)胞(Hep-2)凋亡；②藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與Cox-2、bcl-2基因表達(dá)無(wú)關(guān)；③藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能是激活了一種新型的線粒體凋亡途徑。 第四部分Celecoxib對(duì)人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用 目的：觀察Celecoxib對(duì)人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用，探討其抗腫瘤效應(yīng)及可能的機(jī)理，尋找喉癌治療的新靶點(diǎn)。 方法：建立人喉癌移植瘤裸鼠模型，用Celecoxib處理裸鼠，觀察移植

9、瘤的生長(zhǎng)情況并繪制其生長(zhǎng)曲線。用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)移植瘤中Cox-2和bcl-2mRNA表達(dá)情況，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Cox-2、bcl-2和Caspase-3。 結(jié)果：Celecoxib對(duì)人喉癌裸鼠移植瘤處理后用藥組和對(duì)照組之間裸鼠的體重?zé)o明顯差異(t值為0.017，P值大于0.05)，移植瘤中用藥組腫瘤的體積較對(duì)照組均明顯減小，t=7.75，P＜0.01，統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性意義。在喉癌移植瘤中，用藥組Cox-2和