未知病變類型腦血管中β-amyloid，α-actin，collagenⅣ的免疫組織化學(xué)研究.pdf

1、顱內(nèi)血管破裂后，血液流入蛛網(wǎng)膜下腔時，稱為蛛網(wǎng)膜下腔出血(SubarachnoidHemorrhage，SAH)。SAH約占顱內(nèi)出血的90％，在法醫(yī)病理學(xué)鑒定中較為常見，可分為損傷性和非損傷性兩大類，除嚴重腦外傷外，多在結(jié)構(gòu)脆弱的腦血管處發(fā)生破裂出血。近幾年，中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室通過法醫(yī)尸體解剖及病理檢查發(fā)現(xiàn)部分死者蛛網(wǎng)膜下腔或腦皮質(zhì)淺層小血管結(jié)構(gòu)異常，并伴有不同程度的非外傷性SAH，病變血管正常平滑肌組織結(jié)構(gòu)消失，在H

2、E染色下血管中膜呈均質(zhì)毛玻璃樣粉染結(jié)構(gòu)，嚴重者僅內(nèi)皮殘留，與動脈硬化、腦血管淀粉樣變(Cerebralamyloidangiopathy，CAA)HE染色所見不盡相同。對導(dǎo)致此種病變的具體成因、病理分類尚不清楚，查閱文獻尚無相關(guān)病例報道。 CAA是自發(fā)性顱內(nèi)出血的第三大病因。CAA病變?yōu)槟X血管的正常血管壁由均質(zhì)透明、嗜伊紅染色的淀粉樣物質(zhì)替代，淀粉樣物質(zhì)中沉積有大量4kD的β淀粉蛋白肽(β-amyloid，Aβ)，Aβ是由蛋白酶

3、水解切割β淀粉樣前體蛋白(amyloidprecursorprotein，APP)產(chǎn)生。淀粉樣物質(zhì)經(jīng)剛果紅染色后，在偏振光顯微鏡下可見黃綠色雙折光。CAA淀粉樣物質(zhì)主要沉積于軟腦膜和腦皮質(zhì)的中小血管，CAA的臨床特點是多個腦葉(皮質(zhì)或皮質(zhì)下)出血，且易反復(fù)發(fā)作。Aβ通過破壞血管平滑肌細胞(vesselsmoothmusclecell，VSMC)與細胞外基質(zhì)的粘附，降低VSMC的活力，通過激活凋亡途徑引起VSMC減少，并由淀粉樣物質(zhì)代替V

4、SMC，導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)薄弱，容易引發(fā)血管破裂出血。 VSMC存在于血管中膜，它是決定血管活性、血管構(gòu)型及維持血管張力的重要因素。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為收縮型和增殖型兩種表型。收縮型VSMC呈分化狀態(tài)，不能增殖；增殖型VSMC呈未分化狀態(tài)，可以從中膜遷移至內(nèi)膜，在內(nèi)膜中大量增殖，并成為引起動脈粥樣硬化和血管再狹窄等血管性疾病的主要原因。肌動蛋白(actin)是真核細胞中普遍存在的含量最豐富的蛋白質(zhì)，在肌細胞和非肌細胞中均可見到

5、。肌動蛋白有α、β、γ三種同源型。α-actin主要分布于肌肉細胞中，其中血管平滑肌中的actin又稱為SM-α-actin。VSMC中SM-α-actin的表達很復(fù)雜，涉及到多蛋白啟動復(fù)合物的產(chǎn)生，這種復(fù)合物的形成由與多種CArG構(gòu)件相結(jié)合的血清反應(yīng)因子協(xié)調(diào)。在不同種類的平滑肌細胞中，actin各亞類表達比例不同。SM-α-actin的表達可作為VSMC激話的標志，其表達在VSMC增殖型和收縮型的相互轉(zhuǎn)化過程中發(fā)生相應(yīng)的改變。在不同類

6、型腦血管病變中，SM-α-actin表達不同。 細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)環(huán)繞細胞，參與控制細胞功能、維持細胞分化形態(tài)。其中Ⅳ型膠原蛋白(collagenⅣ)存在于基底膜中或環(huán)繞每一個肌細胞。collagenⅣ可由血管內(nèi)皮細胞或血管平滑肌細胞分泌。collagenⅣ是一個三螺旋蛋白家族，可以促進細胞的粘附、遷移、分化和生長。collagenⅣ家族包括6種在遺傳學(xué)上不相同的鏈：α1(Ⅳ)，α2(Ⅳ

7、)，α3(Ⅳ)，α4(Ⅳ)，α5(Ⅳ)，α6(Ⅳ)，血管中主要是α1(Ⅳ)，α2(Ⅳ)。在動脈硬化玻璃樣變，動脈粥樣硬化，血管淀粉樣變以及老年個體腦血管中，collagenⅣ都存在著特殊的表達。 本研究通過病理組織學(xué)染色技術(shù)、免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，對存在非外傷性SAH的死者腦內(nèi)未知病變類型小血管中β-amyloid、α-actin、collagenⅣ的含量及分布進行研究，以了解其結(jié)構(gòu)特征，并初步進行病理學(xué)分類，以期為今后的病因?qū)W

8、研究及法醫(yī)病理學(xué)鑒定奠定基礎(chǔ)。 材料和方法實驗材料1.主要試劑及來源鼠抗人平滑肌α-actin單克隆抗體(MAB-0003)，鼠抗人collagenⅣ單克隆抗體(MAB-0025)，鼠抗人β-amyloid單克隆抗體(MAB-0505)，即用型超敏SP試劑盒(Kit-9701)均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。DAB顯色劑(ZLI-9032)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 2.實驗儀器石蠟切片機、溫箱、保濕盒、冰箱、高

9、壓鍋、Olympus偏振光顯微鏡、Motic彩色病理圖像分析儀、計算機及SPSSforWindows10.0統(tǒng)計分析系統(tǒng)。 3.檢材收集人腦組織標本共20例，選自中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室2003年至2005年間所作300例連續(xù)尸檢腦組織標本。其中，病變組10例(男：8人，女：2人)，年齡35-70歲，平均年齡：45.7±10歲。尸體保存條件為冰凍保存，均在死亡3周之內(nèi)完成尸檢。尸檢可見不同程度非外傷性SAH，出血較集

10、中區(qū)域病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)部分蛛網(wǎng)膜下腔或腦皮質(zhì)小血管中膜平滑肌組織結(jié)構(gòu)消失，在HE染色下血管中膜呈均質(zhì)毛玻璃樣粉染結(jié)構(gòu)。病變組死亡原因為原發(fā)性腦功能障礙，或其它臟器功能障礙，呼吸循環(huán)衰竭等。對照組10例(男：6人，女：4人)，年齡25-45歲，平均年齡：40±6歲。尸體保存條件為冰凍保存，尸檢均在死亡3周之內(nèi)完成。腦血管解剖及病理組織學(xué)檢查均無異常改變，死因為胸、腹多臟器損傷，呼吸、循環(huán)衰竭等非顱腦損傷性即刻死亡。 二、試驗方法

11、1.標本處理于出血較多的額、顳葉切取腦組織標本，4％緩沖福爾馬林固定，每例制備石蠟組織塊2-3塊。每例每個腦組織石蠟塊制作5μm連續(xù)切片5張。 2.常規(guī)HE染色(1)切片脫蠟，水化；(2)蘇木素染色10min；(3)1％鹽酸酒精中分化后流水沖洗10min；(4)1％伊紅染色5min，蒸餾水洗；(5)切片梯度酒精脫水、二甲苯透明及中性樹膠封片。 3.剛果紅染色(1)切片常規(guī)脫蠟至水；(2)自來水洗滌及蒸餾水洗滌；(3)蘇木

12、素侵染2min；(4)0.1％鹽酸酒精分化3-5s；(5)蒸餾水洗10min；(6)1％剛果紅水溶液染20min；(7)100％酒精分化；(8)二甲苯透明5min；(9)中性樹膠封片。 4.免疫組織化學(xué)染色(1)切片脫蠟，水化；(2)3％H2O2PBS中，室溫下20min滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性；(3)PBS洗滌切片后，鼠抗人平滑肌α-actin單克隆抗體染色不需抗原修復(fù)。鼠抗人collagenⅣ單克隆抗體染色抗原修復(fù)：滴加胃蛋

13、白酶，保濕盒內(nèi)37℃下孵育30min。鼠抗人β-amyloid單克隆抗體染色抗原修復(fù)：置于沸騰的0.01MPH6.0檸檬酸鈉緩沖液中，于高壓鍋內(nèi)加熱加壓至上汽2min，冷卻至室溫，蒸餾水洗滌3min；(4)PBS洗滌切片后，滴加正常山羊非免疫血清，室溫下保濕盒內(nèi)孵育20min； (5)分別滴加1∶100稀釋的鼠抗人平滑肌α-actin單克隆抗體、1∶100稀釋的鼠抗人collagenⅣ單克隆抗體、1∶100稀釋的鼠抗人β-amy

14、loid單克隆抗體，保濕盒內(nèi)室溫下孵育1h； (6)PBS洗滌切片后，滴加生物素標記的二抗，保濕盒內(nèi)室溫孵育20min； (7)PBS洗滌切片后，滴加SP試劑，保濕盒內(nèi)室溫孵育20min；(8)PBS洗滌切片后，配制DAB溶液顯色3-5min；(9)蘇木素中核復(fù)染10min；(10)1％鹽酸-酒精中分化數(shù)s，自來水中分化細胞核10min；(11)切片梯度酒精脫水、二甲苯透明及中性樹膠封片。 5.染色結(jié)果分析(1)

15、剛果紅染色結(jié)果分析淀粉樣物質(zhì)染成淺紅色，偏振光顯微鏡下，淀粉樣物質(zhì)呈黃-綠色雙折光。 (2)a-actin、collagenⅣ、β-amyloid免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的圖像分析 采用Motic彩色病理圖像分析系統(tǒng)，于200倍顯微鏡下選取全部病變血管，并分別對病變組及對照組切片腦組織各隨機選取5個視野，進行定性及半定量分析。 定性分析：根據(jù)染色反應(yīng)的強度分級為：一級(陰性)：血管壁無棕黃色或棕褐色顆粒沉著；+級(陽

16、性)：血管壁可見部分棕黃色或棕褐色顆粒沉著；++級(中度陽性)：血管壁可見較均一的棕黃色顆粒沉著；+++級(強陽性)：血管壁可見較均一的棕褐色顆粒沉著。 半定量分析：測量病變血管壁平均灰度值、對照組正常血管壁平均灰度值以及背景平均灰度值，分別計算血管灰度比(血管壁平均灰度值/背景平均灰度值)。 對照實驗：以PBS代替一抗作陰性對照，已知CAA陽性切片作陽性對照。 6.統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSSforWindows10

17、.0軟件進行秩和檢驗，p＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：本研究通過應(yīng)用病理組織學(xué)染色技術(shù)、免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，對存在非外傷性SAH的死者腦內(nèi)未知病變類型小血管進行了研究，結(jié)果如下：1.病變組死者主要為中青年人，病變腦小血管中不含有β-amylod，血管中膜無collagenⅣ明顯沉積，本類型病變的年齡構(gòu)成及血管壁蛋白成分與CAA不同，為非CAA的未知類型病變。 2.本類型病變的小血管分布于蛛網(wǎng)膜下腔及腦皮質(zhì)，血管管壁增