免疫組織化學

1、免疫組織化學引言引言酶工程是生物工程的重要組成部分，近幾十年來，隨著研究手段的更新和技術(shù)水平的提高，產(chǎn)生了一門以研究酶在細胞內(nèi)的存在及其動態(tài)，以闡明組織細胞的結(jié)構(gòu)和功能為主要內(nèi)容的科學——酶組織化學。酶組織化學是利用酶化學反應的產(chǎn)物可在光學顯微鏡或電子顯微鏡下被識別的特性，借以從形態(tài)學角度判定酶在組織細胞內(nèi)的存在的部位的一門技術(shù)，其基礎(chǔ)是組織化學。它具有將形態(tài)學、生物化學和生理學聯(lián)系起來的特點，在生物學、生物化學、醫(yī)學生物領(lǐng)域內(nèi)日益發(fā)揮

2、著重要的作用。研究組織細胞內(nèi)特定酶分布的酶組織化學方法大致分為：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗體反應（免疫應答）證實酶的存在部位的方法。后者也被稱之為免疫組織化學。免疫組織化學概述免疫組織化學概述免疫組織化學簡稱免疫組化，是應用免疫學及組織化學原理，對組織切片或細胞標本中的某些化學成分，進行原位的定性、定位或定量的研究。這種技術(shù)稱為免疫組織化學技術(shù)。免疫組化是利用抗體與抗原的結(jié)合具有高度特異性的特點，采用一直的抗體檢測組

3、織或細胞的抗原物質(zhì)，以期確定組織或細胞是否存在未知抗原，并進行定性、定位或定量的研究?？乖c抗體結(jié)合形成的免疫復合物是無色的，故必須借助組織化學方法，將抗體抗原反應部位顯示出來。它的主要研究方法是免疫組織染色法（簡稱免疫染色法），食用該方法檢測細胞內(nèi)物質(zhì)，必須具備兩個條件：①作為檢測對象的物質(zhì)須具有抗原性，能制作出與之相應的特異、高效價的抗體；②在免疫反應發(fā)生之前，目標物質(zhì)要保持抗原性，同時還要保持在組織細胞內(nèi)的穩(wěn)定狀態(tài)。要檢測抗原，就

4、要用與之相應的抗體進行免疫反應，同時要用可視的標記標出抗原或抗體，采用這種方法的免疫染色法稱為標識抗體法或標識抗原法，常用的表示抗體法有直接法、間接法、補體結(jié)合法以及多重染色法等。直接法是標識要檢出的抗原的抗體，然后進行反應的方法，其特異性高，但檢出的敏感度不如間接法，標識抗體的食用范圍手局限。間接法是以未標識的第一抗體進行反應，接著標識以第一抗體為抗原所制作的抗體（即第二抗體）進行重疊反應，間接的證明抗原，這種方法的缺點是容易出現(xiàn)非特

5、異性反應，但敏感度較高，標識抗體的用途也廣；補體結(jié)合法是將間接法中的第二抗體作為標識抗補體抗體食用；多重染色法則是在同一標本上檢出多種抗原物質(zhì)的方法，可以用反復進行的重復標記的直接法，也可以用酶標記的重復進行的間接法。此外，還有后標識抗體的免疫染色法，此法先采用未標識的抗體進行反應，反應結(jié)束后，通過免疫化學反應或其他化學反應，用適當?shù)臉擞浳镔|(zhì)來識別已與組織細胞內(nèi)抗原發(fā)生結(jié)合的抗體。免疫組織化學技術(shù)的發(fā)展免疫組織化學技術(shù)的發(fā)展免疫組織化學

6、技術(shù)是形態(tài)學研究領(lǐng)域一門新興方法學。自它問世以來發(fā)展迅猛用“日新月異”一詞形容它毫不過分。酶標免疫組織化學技術(shù)是由Nakane等人于60年代末期創(chuàng)立的最早的免疫酶組織化學技術(shù)之后Sternberger等人于70年代初期便在此基礎(chǔ)上建立了非標記抗體酶法(又稱間接法)和PAP法(過氧化酶抗過氧化酶法)。80年代初期美籍華人Hsu又建立了卵白素生物素復合物法(ABC法)自此之后免疫金銀染色法、免疫電鏡等技術(shù)相繼問世。80年代末期人們又發(fā)現(xiàn)鏈霉

7、菌抗生物素蛋白(或譯成鏈霉菌親合素Streptavidin)與生物素結(jié)合力極強遂用它標記過氧化酶建立起了SP法或稱LSAB法(鏈霉菌親合素生物素過氧化酶法)。由于鏈霉菌親合素不與人組織中的內(nèi)源性生物素起非特異性結(jié)合反應故背景染色更加清晰且敏感性比ABC法高4～8倍比PAP法高8～16倍。進入90年代免疫組織化學又向基因水平深入發(fā)展與分子生物學技術(shù)的結(jié)合日益緊密。如原位雜交后信號的放大與顯示便是采用了免疫組織化學顯色技術(shù)因而又可稱之為原位

8、雜交免疫組織化學技術(shù)。而圖象分析、流式細胞儀的運用，是免疫細胞化學定量分析技術(shù)提高到更精確的水平?，F(xiàn)就該技術(shù)的發(fā)展及其應用作一概述。1利用免疫熒光標記技術(shù)可以分辨出標記抗原抗體所在的位置及其性質(zhì)并可利用熒光定量技術(shù)計算抗原(或抗體)的含量以達到對定性、定位、定量測定的目的[2]。如黃祥瑞等人(1999)利用免疫熒光細胞化學技術(shù)研究西藏環(huán)狀病毒細胞生物學特性和敏感細胞范圍(CPE)成功地觀察到該病毒的細胞病變效應特異熒光發(fā)生的部位、細胞數(shù)

9、量和病毒的形態(tài)發(fā)生。辛德畢斯熱是由辛德畢斯病毒SindbisVirus(SiN)引起的人獸共患蟲媒病毒病1974年南非發(fā)生辛德畢斯熱大流行。1991年梁國棟等通過免疫熒光技術(shù)首次從新疆分離到SiN病毒。1999年陳振光等利用間接免疫熒光試驗檢測到福建寧化林區(qū)人群、野的RNA分子產(chǎn)生自具有質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的cDNA克隆。在1987年Wolf等建議插入確定長度的寡核苷酸至載體內(nèi)產(chǎn)生cRNA分子這種cRNA分子稱為“寡核苷酸核酸探針”(olig

10、oribo－probes)現(xiàn)在已被廣泛的用于原位雜交實驗。國內(nèi)的楊春花等采用免疫組化和cDNA2mRNA原位分子雜交技術(shù)分別檢測了24例RA18例骨關(guān)節(jié)炎(OA)和6例正?；そM織中uPAuPAR蛋白和mRNA的分布及表達情況?？蒲泄ぷ髡吒鶕?jù)免疫組織化學中材料的特性把同位素、生物素、光敏生物素、酶促生物素、地高辛標記cRNA上成功的制成探針。尤其地高辛與放射性標記相比標記探針具有非放射性探針的優(yōu)點對人體無害不受半衰期限制探針可長期保存與

11、生物素標記探針相比不受組織、細胞中內(nèi)源性生物素的干擾敏感性、分辨率較高反應產(chǎn)物顏色鮮艷反差好背景染色低制備探針可較長期保存對人體無害等優(yōu)點已日益顯示出它的優(yōu)越性和廣泛的應用前景。并且進一步研究發(fā)現(xiàn)它能根據(jù)需要人工用DNA合成儀合成其長度及分子大小比較一致可控地高辛同位素寡核苷酸探針。另外放射性同位素、熒光素、生物素也能成功標記寡核苷酸作為探針成功地運用于培養(yǎng)細胞、組織切片和染色體鋪片等的原位雜交中。雖然有些人認為其敏感度不如來自質(zhì)粒擴增

12、的cRNA或DNA探針但由于探針制備簡便再加之于近年非放射性標記的成功寡核苷酸探針在生物基礎(chǔ)醫(yī)學及臨床學科領(lǐng)域中得到較為廣泛的應用。免疫細胞化學技術(shù)與流式細胞術(shù)(FCM)結(jié)合進行多參數(shù)FCM分析血液淋巴細胞免疫表型(亞群)方法學因素對實驗結(jié)果的影響。當血液采集后1h和6h測定淋巴細胞免疫表型結(jié)果差異無顯著。如黃勇華等采用單標或雙標直接免疫熒光標記法標記20種細胞表面分化抗原經(jīng)流式細胞儀測定。后進行分析185例白血病患者骨髓或外周血白血病

13、細胞的免疫分型及CD117的表達細胞表面分化抗原(CD)117在各型白血病中的表達及其意義。免疫細胞化學技術(shù)先進儀器和方法結(jié)合已呈現(xiàn)新的趨勢，如用熒光顯微分光光度計和圖像分析儀等定量檢測將結(jié)果客觀打印、報告這更適合于臨床診斷和科學研究。如楊希謙等采用非放射碘標記人直腸癌相關(guān)抗原單克隆抗體(McAb)技術(shù)與生物導向CT顯像進行腫瘤的免疫組化鑒定與免疫顯像研究。免疫組織化學技術(shù)在臨床病理診斷中的重要作用免疫組織化學技術(shù)在臨床病理診斷中的重要

14、作用100年前發(fā)明的用光學顯微鏡觀察HE染色切片法仍然是當前各級醫(yī)院病理科中的基本方法。該方法的局限性在于僅能從細胞水平反映疾病性質(zhì)診斷中觀察者的主觀推測成份高常常是同一疾病出現(xiàn)分歧頗大的數(shù)個不同診斷多年來成為臨床病理診斷中的突出問題。而免疫組織化學方法是通過抗原抗體反應客觀地反映疾病性質(zhì)在觀察HE切片基礎(chǔ)上再結(jié)合免疫組織化學染色結(jié)果可對某一疾病做出較為客觀公正的評價從而可避免主觀因素的影響。自免疫組織化學技術(shù)應用于臨床病理診斷以來在以

15、下幾類疾病的鑒別診斷中發(fā)揮著重要作用。1高度未分化腫瘤細胞起源的鑒別:發(fā)生在胃腸道的這類腫瘤應首選CEA與Vimentin兩種抗體鑒別是上皮源性抑或是間葉源性腫瘤。因為CEA在消化道上皮源性腫瘤的陽性率高但在鱗癌時陽性率低而消化道以外部位發(fā)生者上皮性標記物宜選用EMA該抗體在90%以上上皮源性腫瘤呈陽性表達。2小圓細胞腫瘤的鑒別:小圓細胞腫瘤包括小細胞未分化癌、惡性淋巴瘤、小細胞軟組織肉瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤以及小細胞黑色素瘤。這類腫瘤鑒別

16、診斷時應使用EMA或CEALCAVimentinNSES100和HMB45抗體。3大細胞型腫瘤鑒別:這類腫瘤可以是大細胞未分化癌、低分化肉瘤、大細胞性黑色素瘤和大細胞性惡性淋巴瘤。在鑒別診斷時應該選用EMA或CEAVimentinS100和LCA抗體。4梭形或多形性軟組織肉瘤的鑒別:此類腫瘤包括平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、梭形細胞血管肉瘤、梭形細胞黑色素瘤、多形性橫紋肌肉瘤、多形性惡性纖維組織細胞瘤以及多形性脂肪肉瘤。以下抗體可用于鑒別診斷:

17、ActinEMAFⅧAgS100MB45MyoglobinDesminα12AT以及α12ACT。5惡性淋巴瘤分型:在免疫組織化學研究領(lǐng)域，當前對惡性淋巴瘤的免疫組織化學研究最為活躍與細致。截止目前為止已有下列亞型可以通過免疫組織化學染色確立。它們是:B細胞淋巴瘤L26陽性LN2陽性T細胞淋巴瘤MT1陽性UCHL1陽性NK細胞淋巴瘤C123C陽性樹突網(wǎng)織細胞淋巴瘤Ber2MAC2DRC陽性指狀突網(wǎng)織細胞淋巴瘤S100陽性真性組織細胞淋巴