cripto基因siRNA化學(xué)合成和對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、分類(lèi)號(hào)U D C密級(jí)編號(hào)浙江大學(xué)( 浙江新和成股份有限公司)博士后研究工作報(bào)告c r i p t o 基因s i R N A 化學(xué)合成和對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響工作完成日期：提交報(bào)告日期：范鈺2 Q Q 5 生2 旦2 Q Q 5 生3 目浙江大學(xué)( 浙江)2 0 0 5 年3 月篇一部分c r i p t o 基因s i R N A 的合成前言惡性腫瘤是一種危害人類(lèi)生命健康的主要疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，每年全世界新發(fā)惡性腫瘤病人

2、約1 0 0 0 萬(wàn)，死于腫瘤的6 0 0 ～7 0 0 萬(wàn)。在我國(guó)，每年新發(fā)病約2 0 0 萬(wàn)，死亡約1 4 0 萬(wàn)／按1 3 億人口計(jì)算) 。隨著人口老齡化、吸煙、生活方式的城市化和工業(yè)化影響的進(jìn)一步加強(qiáng)，這一趨勢(shì)將繼續(xù)下去。腫瘤為多機(jī)制的復(fù)雜疾病，目前仍用早期診斷、手術(shù)、放療、化療等手段，療效有限，且給病人帶來(lái)較大的痛苦。結(jié)腸癌是目前我國(guó)發(fā)病率增長(zhǎng)最快的腫瘤之一。轉(zhuǎn)移及化療耐藥是結(jié)腸癌治療的最大難題，目前尚缺乏有效的治療手段及藥物

3、，尋找有效的治療藥物和治療手段，乃當(dāng)務(wù)之急。徹底攻克結(jié)腸癌等惡性腫瘤的艱巨任務(wù)只能通過(guò)以上治療手段結(jié)合免疫治療、基因治療等綜合治療手段來(lái)完成。在基因治療領(lǐng)域中，R N A 干擾和小干擾核糖核酸分子( s m a l li n t e r f e r i n g R N A ，s i R N A )引起了廣泛的注意。R N A 干擾，又稱(chēng)R N A 干涉( R N Ai n t e r f e r e n c e ，R N A i ) )

4、 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)m R N A 的生物學(xué)現(xiàn)象，能夠使基因表達(dá)的m R N A 被相應(yīng)的敬鏈R N A 分子敲除，其效果要遠(yuǎn)強(qiáng)于正義和反義R N A 【l J 。目前的研究表明，參與這種R N A i 作用的主要分子是雙鏈R N A ，在細(xì)胞內(nèi)是以2 1 ～2 3 個(gè)核苷酸的形式發(fā)揮作用的，而且已有人工合成的雙鏈s i R N A ，具有明顯的敲除相應(yīng)基因m R N A 的效果¨J 。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中對(duì)腫瘤正相關(guān)基因的

5、抑制，無(wú)疑是一個(gè)值得探索的方向。大多數(shù)實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展與癌基因的激活與擴(kuò)增有關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)，畸胎瘤衍生生長(zhǎng)因子一( C r i p t o ) 基因與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?。C r i p t o 是一種白分泌裂腫瘤生長(zhǎng)因子，是表皮生長(zhǎng)因子( E G F ) 家族成員之一。該基因最早在人和小鼠胚胎腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、陰莖癌、膀胱癌及前列腺癌等中均呈過(guò)度表達(dá)，而它在正常組織中都不表達(dá)或低

6、表達(dá)I j l J 。提示該基因在結(jié)腸癌等惡性腫瘤的形成發(fā)展中扮演著重要的角色。由此提示，它可作為一個(gè)惡性腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)。為此，本研究首先針對(duì)c r i p t om R N A 編碼區(qū)特點(diǎn)，采用化學(xué)方法合成了1 2 個(gè)s i R N A 。其次采用實(shí)時(shí)定量P C R 篩選出2 個(gè)效果最好的s i R N A 。為深入探討所設(shè)計(jì)合成s i R N A 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響．本研究觀察了s i R N A 轉(zhuǎn)染對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞

7、端粒酶活性和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的影響，轉(zhuǎn)染s i R N A 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、失巢凋亡和蛋白激酶B ( A k t ) 磷酸化的影響。材料和方法l 材料2 S i R N A 合成 本s i R N A 由杭州新瑞佳生物技術(shù)公司合成。所有的s i R N A 分子都經(jīng)過(guò)2位上脫保護(hù)、脫鹽、純化、和退火形成雙鏈處理，然后溶于焦碳酸二乙酯處理的蒸餾水中。整個(gè)化學(xué)合成可大致分成四個(gè)的過(guò)程( 1 ) 寡聚核糖核酸的合成；( 2 ) 脫保護(hù)；(

8、3 ) 純化分離；( 4 ) 脫鹽退火無(wú)菌消毒。具體制備操作如下：( 1 ) 寡聚核糖核酸的合成：S i R N A 的合成是在自動(dòng)D N A ／R N A 合成儀( A p p l i e d B i o s y s t e m sE X P E D I T E 8 9 0 9 ) 上進(jìn)行，根據(jù)設(shè)計(jì)的小干擾R N A 分子的核酸序列的次序?qū)?duì)應(yīng)的核苷酸逐個(gè)連接起來(lái)。第一步是將與固相連接的胸營(yíng)上5 ’位的保護(hù)基在3 ％三氯乙酸的作用下洗

9、脫：第二步在活性催化劑S - 乙基四唑的作用下，將5 ’．0 ．對(duì)二甲氧基三苯甲基．胸苷亞磷酰胺偶聯(lián)到已脫去保護(hù)的上一個(gè)胸苷上，形成二胸苷亞磷酸三酯。偶合時(shí)間和偶合循環(huán)的次數(shù)均按儀器廠家提供程序來(lái)完成；第三步是將偶合的二二胸苷亞磷酸三酯在o ．0 5M 碘水的作用下氧化成二胸苷磷酸三酯；四步是乙酰化，將圃相上的少量未反應(yīng)的活性基團(tuán)( 例如：羥基和胺基) 在乙酸酐的作用下形成酯或酰胺．從而達(dá)到封閉作用，用以減少整體副產(chǎn)物的產(chǎn)生。重復(fù)此循環(huán)