慢病毒介導(dǎo)的Bmi-1基因沉默對(duì)骨髓瘤細(xì)胞生物學(xué)特性及硼替佐米敏感性影響的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建Bmi-1 shRNA慢病毒表達(dá)載體以沉默Bmi-1基因的表達(dá)，建立穩(wěn)定干擾Bmi-1基因的骨髓瘤細(xì)胞株；研究Bmi-1基因沉默對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株U266和RPMI8226生物學(xué)特性及對(duì)硼替佐米敏感性的影響及其機(jī)制。
　　方法：設(shè)計(jì)合成一對(duì)針對(duì)Bmi-1 mRNA的shRNA序列，利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體—pLVTHM-shBmi-1，空載體作為對(duì)照組，分別與包裝載體psPAX2及PMD2.G共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)

2、胞，包裝出高滴度的病毒顆粒；感染骨髓瘤細(xì)胞株U266和RPMI8226，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀分選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。接著應(yīng)用real-timePCR和Western blot分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)Bmi-1及p14的表達(dá)；CCK-8法檢測(cè)穩(wěn)定株細(xì)胞增殖；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定株細(xì)胞克隆形成能力；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)穩(wěn)定株細(xì)胞周期和凋亡的變化；AO/EB染色、Hoechst33258熒光染色法觀察穩(wěn)定株細(xì)胞凋亡形態(tài)；Western blot

3、檢測(cè)P21、Bax和Bcl-2蛋白水平改變。進(jìn)一步，采用CCK-8法、克隆形成法、流式細(xì)胞術(shù)和熒光染色法分別從細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞周期和凋亡、Western blot等方面研究Bmi-1基因沉默對(duì)骨髓瘤細(xì)胞硼替佐米敏感性的影響及其機(jī)制。
　　結(jié)果：(1)成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLVTHM-shBmi-1。(2)成功建立穩(wěn)定細(xì)胞株：real-timePCR和Western blot結(jié)果顯示干擾組細(xì)胞Bmi-1 mRNA和蛋白水平

4、表達(dá)均下調(diào)，說(shuō)明穩(wěn)定干擾Bmi-1的骨髓瘤細(xì)胞株成功建立。(3)Bmi-1基因沉默對(duì)穩(wěn)定株細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響：○1 CCK-8結(jié)果顯示：48～96小時(shí)與對(duì)照組相比，U266及RPMI8226干擾組細(xì)胞增殖抑制率分別為22.83～25.1％和13.9～26.9%；○2克隆形成顯示：Bmi-1基因沉默抑制骨髓瘤細(xì)胞的克隆形成能力；○3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示：U266細(xì)胞：對(duì)照組和干擾組G1期細(xì)胞比率分別為39.91%

5、±0.26%和45.65%±0.68%；RPMI8226細(xì)胞：對(duì)照組和干擾組G1期細(xì)胞比率分別為42.7%±0.47%和50.86%±0.38%；○4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：U266細(xì)胞：對(duì)照組和干擾組的凋亡率分別為9.8%及12.12%，RPMI8226細(xì)胞：對(duì)照組和干擾組的凋亡率分別為9.6%及15.69%。(4)Bmi-1基因沉默增強(qiáng)骨髓瘤細(xì)胞對(duì)硼替佐米的敏感性：○1不同濃度的硼替佐米分別處理對(duì)照組和干擾組細(xì)胞72小時(shí)，細(xì)

6、胞增殖明顯受抑制，干擾組聯(lián)合用藥作用更明顯，IC50分別為：U266對(duì)照組24.73nmol/L，干擾組18.59nmol/L；RPMI8226對(duì)照組32.99nmol/L，干擾組21.56nmol/L；○2聯(lián)合40nmol/L硼替佐米處理細(xì)胞48小時(shí)，干擾組細(xì)胞加藥周期阻滯更明顯：U266細(xì)胞：對(duì)照組和干擾組G1期細(xì)胞比率分別為45.35%±0.77%和56.81%±0.50%；RPMI8226細(xì)胞：對(duì)照組和干擾組G1期細(xì)胞比率分別為

7、49.27%±0.90%和56.94%±0.61%；○3聯(lián)合40nmol/L硼替佐米處理細(xì)胞48小時(shí)，干擾組細(xì)胞凋亡率增加：U266細(xì)胞：對(duì)照組和干擾組的凋亡率分別為20.83%和28.14%，RPMI8226細(xì)胞：對(duì)照組和干擾組的凋亡率分別為22.5%和49.14%；○4Western blot檢測(cè)p21、Bcl-2、Bax蛋白水平結(jié)果顯示：干擾組p21、Bax表達(dá)上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bc l-2表達(dá)下調(diào)，加藥處理后上述改變更明顯。