Sema3F導致大鼠海馬神經(jīng)元軸突生長錐塌陷的分子機制研究.pdf

1、癲癇(Epilepsy)是一種發(fā)作性疾病，是腦內(nèi)神經(jīng)元群過度放電所引起的陣發(fā)性腦功能障礙，小兒癲癇發(fā)病率大約3‰～6‰，其中約1/3使用藥物難以控制，稱為難治性癲癇(Refraocow Seizures)。小兒難治性癲癇原因很多，研究表明，常見的與下列一些因素有關。腦部病理性損傷：包括海馬硬化、額葉中部硬化、腦皮質(zhì)發(fā)育不良、結(jié)節(jié)性硬化、腦神經(jīng)元移行障礙、多腦回、巨小腦回。研究表明，在分子水平，苔蘚纖維出芽(Mossy Fiber Spr

2、outing，MFS)是癲癇發(fā)作后最常見的病理改變之一，與癲癇的反復自發(fā)性發(fā)作密切相關。在癇性損傷后由于門區(qū)神經(jīng)元和CA3區(qū)錐體細胞大量死亡，齒狀回內(nèi)分子層(IML)失神經(jīng)傳入，同時顆粒細胞也失去投射靶，因此苔蘚纖維芽生側(cè)枝進入顆粒體層、IML以及CA3區(qū)始層，重建海馬神經(jīng)網(wǎng)絡，沖動便在再生神經(jīng)回路中迅速傳播，最終導致癲癇反復發(fā)作。研究表明，腦信號轉(zhuǎn)導蛋白Semaphorin家族表達異常與MFS的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關。
　　

3、Sema3F是Semaphorins家族中的一員，其功能包括：血管發(fā)生、細胞附著、細胞遷移、細胞的增殖、細胞骨架的組成、肺的形成、神經(jīng)細胞的連接、腫瘤的轉(zhuǎn)移、腫瘤的抑制、突觸的傳遞等。在海馬和內(nèi)嗅皮質(zhì)區(qū)的發(fā)育過程中可監(jiān)測到分泌型Sema3F，它的受體neuropilin-2僅存在于海馬。Sema3F對CA1區(qū)、CA3區(qū)的軸突有明顯的排斥作用，而對內(nèi)嗅皮質(zhì)區(qū)的軸突沒有作用。對Neuropilin-2基因敲除小鼠的研究表明，離體情況下，海馬

4、的軸突失去了對Sema3F的反應性，并觀察到錐體苔蘚纖維束軸突發(fā)育的明顯缺陷，還在這種小鼠中觀察到該纖維束向CA1區(qū)過度生長，表明Sema3F可終止苔蘚纖維的生長。
　　 Semaphorins能夠限制損傷后的軸突再生，抑制異常的軸突發(fā)芽，并且參與疼痛和神經(jīng)的自發(fā)功能。在免疫系統(tǒng)，Semaphorins在各個免疫反應環(huán)節(jié)均有重要作用。還有研究表明Semaphorins還與心血管疾病有關。Semaphorins在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作

5、用是研究比較多的，在體內(nèi)、體外的許多研究表明Semaphorins可以使軸突識別并且與另一個神經(jīng)細胞或靶位連接。Semaphorins誘導軸突延伸的重要機制是抑制或阻止這些神經(jīng)元軸突進入到某些區(qū)域，例如，將Semaphorins基因突變大鼠在體內(nèi)、體外均觀察到軸突進入到了不恰當?shù)膮^(qū)域。在成年個體研究中也觀察到Semaphorins在一些病理、生理過程中起著重要作用，研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)的一些疾病的發(fā)生、發(fā)展與Semaphorins功能變化

6、有關系，例如，癲癇、視網(wǎng)膜變性、阿爾海默茨病、運動神經(jīng)元變性、精神分裂癥、帕金森氏病等。
　　 目前Sema3F生理功能的分子機制還不是很清楚，研究Sema3F的分子機制可以為癲癇、視網(wǎng)膜變性、運動神經(jīng)元變性、神經(jīng)損傷的發(fā)病機制提供理論依據(jù)，為癲癇，神經(jīng)損傷后再生的治療提供一個潛在的靶位點。
　　 實驗材料及方法：
　　 一、新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)(一)動物的選擇：新生24小時之內(nèi)的Wistar大鼠由中國醫(yī)科

7、大學附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心提供。
　　 (二)大鼠原代海馬神經(jīng)元提取：取出生24h內(nèi)新生的Wistar大鼠雙側(cè)海馬提取原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元。
　　 (三)接種：用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，根據(jù)培養(yǎng)皿的不阿調(diào)節(jié)細胞終濃度，培養(yǎng)皿(2ml)，6孔板(2ml)或培養(yǎng)瓶(3ml)接種密度為2.0-3.0×106/ml，用于Western blot和Reeal-time PCR接種密度4.0-5.0×104/ml用于細胞爬片，倒置相差顯

8、微鏡下觀察細胞形態(tài)。
　　 (四)換液：接種后的細胞在37℃5％CO2孵箱中過夜，次日棄去接種培養(yǎng)基，37℃預熱的PBS沖洗2次，用完全培養(yǎng)基全量換液，如果試驗需要，此后每周2-3次半量換液。
　　 二、實驗樣本的采集和處理(一)細胞爬片處理：37℃預熱的PBS沖洗2次后，用4%的多聚甲醛固定30分鐘，去上清，PBS沖洗3次，-20℃凍存。用于熒光染色檢測，熒光共聚焦檢測，免疫組織化學檢測。
　　 (二)細胞的收

9、集：37℃預熱的PBS沖洗2次后，將細胞培養(yǎng)皿置于冰塊上，用細胞刮刀輕輕將細胞刮下，收集到1.5ml離心管中，4℃離心后去上清，經(jīng)液氮轉(zhuǎn)移到-70℃冰箱保存待檢。用于Real-Time PCR和Western Blot檢測。
　　 (三)電穿孔轉(zhuǎn)染：新提取出的大鼠海馬神經(jīng)元在電轉(zhuǎn)儀內(nèi)進行電穿孔轉(zhuǎn)染，將外源性RNA轉(zhuǎn)入原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元。
　　 (四)慢病毒轉(zhuǎn)染：培養(yǎng)24小時的大鼠海馬原代神經(jīng)元應用慢病毒作為載體將外源性基

10、因轉(zhuǎn)入原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元。
　　 三、實驗方法及檢測指標(一)免疫組織化學檢測：細胞免疫組織化學檢測，計數(shù)100個有核細胞，計算海馬神經(jīng)元提取純度。
　　 (二)免疫熒光檢測：細胞免疫熒光檢測分別檢測受體Npn-2細胞內(nèi)的表達分布，生長錐的形態(tài)學改變并計數(shù)。
　　 (三)激光共聚焦免疫熒光檢測：細胞激光共聚焦檢測觀察Npn-2細胞內(nèi)的表達分布，神經(jīng)元生長錐形態(tài)學變化，并計算面積。
　　 (四)Real-T

11、ime PCR：檢測細胞中Npn-2，p53mRNA表達量的變化。
　　 (五)Western Blot：檢測細胞中Npn-2，P53蛋白含量的變化。
　　 (六)Time Lapse：動態(tài)觀察生長錐形態(tài)改變。
　　 (七)倒置顯微鏡：觀察細胞形態(tài)，計數(shù)慢病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　 四、統(tǒng)計學分析計數(shù)資料用x±S%表示，計量資料用x±S表示，計數(shù)資料采取卡方檢驗，計量資料采取方差分析，統(tǒng)計軟件采用SPSS11.

12、3，P<0.05提示有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)并鑒定倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元剛接種時呈圓形，在體外培養(yǎng)30分鐘開始貼壁，2小時后大部分細胞貼壁，呈圓形或橢圓形，部分細胞開始長出1到2個突起。培養(yǎng)至第2天神經(jīng)元胞體增大，呈圓形、梭形、三角形或多邊形，胞質(zhì)豐富，突起明顯延長，形態(tài)多樣，可見單個、多個突起。培養(yǎng)至3天，神經(jīng)元突起延伸，像絲帶狀連接在一起開始形成神經(jīng)元網(wǎng)絡。

13、應用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)特異性標記神經(jīng)元，在顯微鏡下計數(shù)，結(jié)果神經(jīng)元的純度大于95%。
　　 二、Sema3F誘導原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元軸突生長錐塌陷培養(yǎng)至第3天的新生大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入Sema3F，依據(jù)試驗需要，應用不同濃度作用不同時間，結(jié)果顯示，Sema3F對新生大鼠海馬神經(jīng)元軸突生長錐塌陷作用，表現(xiàn)為劑量依賴性和時間依賴性的特點。
　　 三、Sema3F作用于原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元后，可以使其受體Npn-

14、2發(fā)生內(nèi)化Sema3F10ng/ml的濃度作用海馬神經(jīng)元1小時后，神經(jīng)元細胞漿內(nèi)出現(xiàn)熒光染色后粗大的顆粒，主要集中在細胞膜的周圍，而作用30分鐘和使用同等劑量的BSA，作用1小時均未出現(xiàn)這種現(xiàn)象，說明Npn-2受體有內(nèi)化的功能。
　　 四、Npn-2介導了Sema3F對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元軸突的排斥性導向作用選擇特異性抑制Npn2序列和對照序列進行轉(zhuǎn)染，抑制Npn-2在原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中的表達，加入Sema3F計算軸突塌陷比例，

15、結(jié)果抑制后的神經(jīng)元軸突塌陷比率為：28.34±2.20%，對照序列轉(zhuǎn)染后塌陷比率為：99.44±0.74%，經(jīng)過卡方檢驗P<0.01，兩組間的差異有統(tǒng)計學意義。
　　 五、抑制P53功能或抑制P53表達可以導致原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元軸突生長錐塌陷P53-siRNA和陰性對照siRNA序列通過電穿孔轉(zhuǎn)染后72小時，大鼠海馬神經(jīng)元軸突生長錐塌陷率為：62.22±26.30%，對照組為：13.33±7.78%，P<0.01，兩組間的差異有

16、統(tǒng)計學意義。P53抑制劑Pifithrin-α對大鼠海馬神經(jīng)元生長錐具有誘導塌陷作用。
　　 六、P53高表達可以促進原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元軸突生長錐的生長應用慢病毒轉(zhuǎn)染技術高表達P53，P53的高表達可以促使大鼠海馬神經(jīng)元生長錐面積的擴大。
　　 七、Sema3F通過作用于Npn-2，下調(diào)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中的P53的表達Sema3F作用于原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元可以抑制p53mRNA和P53蛋白表達量的下降，抑制了Npn-2后

17、這一作用被阻斷了。
　　 八、在原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中高表達P53可以減弱Sema3F導致軸突生長錐塌陷的作用Sema3F作用P53高表達的神經(jīng)元30分鐘后塌陷率為：71.11±22.96%，Sema3F作用對照組30分鐘后塌陷率為：99.17±1.94%，P<0.01。說明高表達P53后，Sema3F對于軸突生長錐的塌陷作用被部分的抑制了，Sema3F對海馬軸突生長錐的作用部分是通過降低P53表達量來實現(xiàn)的。
　　 結(jié)論