SEMA3F通過下調(diào)ASCL2-CXCR4軸而抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制.pdf

1、結(jié)直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其致死的主要原因是轉(zhuǎn)移。在沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中，5年生存率為80-90％；而發(fā)生了轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的5年生存率只有10-20%。因此，尋找結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)記和治療靶點(diǎn)具有重要的科學(xué)意義和使用價(jià)值。
　　在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，神經(jīng)元軸突需要遷移到全身各個(gè)組織和器官，這個(gè)過程受到精密的調(diào)控。3型神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子家族由分泌型軸突導(dǎo)向分子組成，這些分子能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突的遷移方向。除了在中

2、樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，越來越多的研究表明，包括SEMA3F在內(nèi)的3型神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子在其它系統(tǒng)也有表達(dá)。這些分子在腫瘤血管新生、腫瘤生長以及轉(zhuǎn)移中都有重要作用。鑒于腫瘤轉(zhuǎn)移的過程與神經(jīng)元軸突遷移的過程具有一定的相似性，課題組前期研究了SEMA3F在結(jié)直腸癌中的作用，發(fā)現(xiàn)SEMA3F在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，且SEMA3F能夠抑制結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移。但是SEMA3F的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，以及SEMA3F抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不清。

3、>　　趨化因子受體CXCR4是第一個(gè)被證明在腫瘤轉(zhuǎn)移中有關(guān)鍵作用的趨化因子受體。CXCR4促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞向肺和骨髓轉(zhuǎn)移，因?yàn)镃XCR4的配體CXCL12在肺和骨髓中高表達(dá)。在被CXCL12激活后，CXCR4能夠通過多條信號通路傳導(dǎo)趨化、侵襲遷移，增殖和干性信號。阻斷CXCR4的功能能夠減少結(jié)腸癌細(xì)胞向肝臟和肺轉(zhuǎn)移。臨床研究表明，高表達(dá)CXCR4與結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)、肝轉(zhuǎn)移正相關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，肝臟星形細(xì)胞分泌的CXCL12能夠促進(jìn)表達(dá)CX

4、CR4的結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，而CXCR4的抑制劑AMD3100能夠顯著減少肝轉(zhuǎn)移。
　　ASCL2(Achaete scute-like2)是一個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)家族轉(zhuǎn)錄因子，在通過HLH結(jié)構(gòu)域形成二聚體后，它能夠通過自身的堿性結(jié)構(gòu)域與E-box(CANNTG)結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。ASCL2基因位于11號染色體斷臂1區(qū)5帶5亞帶，結(jié)直腸癌中這個(gè)區(qū)域常常發(fā)生印跡缺失。以往在消化道腫瘤中進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，ASCL2在消化道

5、腫瘤中高表達(dá)，并受到WNT信號通路的調(diào)節(jié)。進(jìn)一步的研究表明，ASCL2調(diào)節(jié)消化道干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)GR5的表達(dá)，并影響消化道干細(xì)胞的干性。敲低ASCL2能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、克隆形成和侵襲。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中SEMA3F的表達(dá)比正常腸上皮細(xì)胞低，同時(shí)SEMA3F也抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。但是SEMA3F在結(jié)直腸癌中的臨床預(yù)后價(jià)值，以及它抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不清楚。我們利用免疫組織化學(xué)在303例結(jié)直腸癌

6、病人標(biāo)本中檢測了SEMA3F的表達(dá)，并用Kaplan-Meier分析了SEMA3F的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。通過RT-PCR，Western blot,免疫熒光、流式細(xì)胞檢測等方法檢測了SEMA3F對CXCR4表達(dá)的影響，并研究了相關(guān)分子機(jī)制。
　　主要結(jié)果和結(jié)論：
　　1.低表達(dá)SEMA3F的結(jié)直腸癌患者中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率更高，預(yù)后更差
　　51.2%(155/303)的結(jié)直腸癌標(biāo)本中SEMA3F呈低表達(dá)。低表達(dá)

7、SEMA3F與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，但與性別、發(fā)生部位、腫瘤大小、分化程度和T分期無顯著相關(guān)。SEMA3F在正常腸上皮中高表達(dá)，在結(jié)直腸癌中表達(dá)降低，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)更低。Kaplan-Meier生存分析表明SEMA3F低表達(dá)的患者總體生存時(shí)間更短。
　　2.SEMA3F通過下調(diào)CXCR4抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲遷移
　　敲低SEMA3F后CXCR4的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)都顯著增加，而過表達(dá)SEMA3F后C

8、XCR4的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)都顯著減少。同時(shí)，不管是敲低或過表達(dá)CXCR4，還是CXCR4抑制劑AMD3100處理，對SEMA3F的表達(dá)都沒有影響。敲低和過表達(dá)SEMA3F分別增加和降低細(xì)胞侵襲和遷移能力。CXCR4的配體CXCL12增加敲低SEMA3F的細(xì)胞的侵襲和遷移能力，且呈劑量依賴關(guān)系。但是CXCL12不能增加過表達(dá)SEMA3F細(xì)胞的侵襲和遷移能力。敲低SEMA3F的細(xì)胞中再敲低CXCR4后，細(xì)胞侵襲遷移能力顯著減少；過表達(dá)SEMA3F

9、的細(xì)胞再過表達(dá)CXCR4后，細(xì)胞侵襲遷移能力顯著增加。
　　3.SEMA3F通過PI3K-AKT信號通路下調(diào)ASCL2-CXCR4軸
　　敲低SEMA3F后結(jié)直腸癌細(xì)胞中ASCL2的表達(dá)上調(diào)，而過表達(dá)SEMA3F則下調(diào)ASCL2的表達(dá)。敲低ASCL2后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的CXCR4下調(diào)，而過表達(dá)ASCL2則上調(diào)CXCR4。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，ASCL2促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中CXCR4的轉(zhuǎn)錄。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ASCL2

10、能夠與CXCR4的啟動子區(qū)結(jié)合。敲低SEMA3F后AKT磷酸化增加，但ERK1/2和JNK的磷酸化無明顯變化。同樣，過表達(dá)SEMA3F減少AKT磷酸化，但不影響ERK1/2和JNK的磷酸化。PI3K抑制劑LY294002能夠顯著降低ASCL2和CXCR4的表達(dá)，但對SEMA3F的表達(dá)沒有作用。
　　4.高表達(dá)ASCL2的結(jié)直腸癌患者的預(yù)后更差，且ASCL2促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移
　　119例結(jié)直腸癌患者標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，47

11、.1%(56/119)的標(biāo)本中ASCL2高表達(dá)。ASCL2高表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤大小和腫瘤部位顯著相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)ASCL2的患者的總體生存時(shí)間比低表達(dá)的患者更短。敲低ASCL2不僅顯著降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲，同時(shí)也降低了CXCL12對腫瘤細(xì)胞的趨化作用。相反，過表達(dá)ASCL2則顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，并增加CXCL12對細(xì)胞的趨化作用。裸鼠肝轉(zhuǎn)移模型中，敲低ASCL2顯著減少肝轉(zhuǎn)移的發(fā)

12、生，而過表達(dá)ASCL2則顯著增加肝轉(zhuǎn)移。
　　5．抑制CXCR4能夠抑制敲低SEMA3F對細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。
　　雖然CXCR4抑制劑AD3100能同時(shí)降低對照組細(xì)胞和SEMA3F敲低細(xì)胞的侵襲能力，但是高濃度AMD3100(5或10μM)處理下，對照組細(xì)胞和SEMA3F敲低細(xì)胞的侵襲能力相近。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，SEMA3F敲低細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率更高(100% vs77.8%)，肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)更多(5.0vs1.33)。雖然

13、AMD3100顯著抑制對照組細(xì)胞(1.33到0.33)和SEMA3F敲低細(xì)胞(5.0到1.0)肝轉(zhuǎn)移，但是SEMA3F敲低組降幅更大。
　　6.結(jié)直腸癌中SEMA3F和CXCR4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　TCGA數(shù)據(jù)庫中229例結(jié)直腸癌基因表達(dá)分析結(jié)果表明，SEMA3F和CXCR4基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。85例人結(jié)直腸癌標(biāo)本的免疫組織化學(xué)檢測驗(yàn)證了 SEMA3F和CXCR4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。SEMA3F陰性/CXCR4陽性的患者生存時(shí)間