禽（番鴨）呼腸孤病毒YB株S3與S4 ORF2基因的表達(dá)、純化及免疫原性研究.pdf

1、本研究用已構(gòu)建的表達(dá)禽(番鴨)呼腸孤病毒s3和S4 ORF2基因的原核表達(dá)載體pET-30a/S3、pET-30a/S4 ORF2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)后裂解菌體作SDS-PAGE，分別出現(xiàn)大小約36KD和43KD的表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)Western-blot驗(yàn)證重組蛋白具有DRV抗原性，通過(guò)摸索不同誘導(dǎo)時(shí)間、不同誘導(dǎo)所需IPTG濃度、不同誘導(dǎo)溫度優(yōu)化了σ3和σC蛋白的表達(dá)條件：對(duì)σB，用終濃度為0.5mM的IPT

2、G誘導(dǎo)，于37℃振蕩培養(yǎng)5h；對(duì)σC用終濃度為0.8-1.0mM的IPTG誘導(dǎo)，于37℃振蕩培養(yǎng)3h。融合蛋白以包涵體的形式存在，分別采用螯合親和層析和尿素洗滌純化了包涵體中的融合蛋白。 利用純化的DRV重組σC蛋白作為抗原致敏乳膠，并優(yōu)化了致敏乳膠的最佳濃度，溫度和時(shí)間，初步建立了檢測(cè)DRV抗體的乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)。試驗(yàn)結(jié)果表明，抗體致敏乳膠敏感性高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好。σ用1日齡雛番鴨免疫評(píng)價(jià)了禽(番鴨)呼腸孤病毒衣殼蛋

3、白GB和σC亞單位疫苗在番鴨體內(nèi)的免疫原性。接種σB，σC和σB+σC重組亞單位疫苗的番鴨用相同病毒攻毒后分別出現(xiàn)50％，40％和30％的死亡率，陽(yáng)性對(duì)照組番鴨攻毒后出現(xiàn)70％的死亡率。 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的禽(番鴨)呼腸孤病毒YB株S3和S4 ORF2基因序列，采用SOPMA法、Gamier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schultz法方法預(yù)測(cè)了其結(jié)構(gòu)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，用Hopp-Wroods方法對(duì)結(jié)

4、構(gòu)蛋白的親水性進(jìn)行了分析，用Emini方法預(yù)測(cè)了σB和σC蛋白的表面可能性，以Jameson-wolf和吳玉章等建立的方法預(yù)測(cè)了蛋白的抗原指數(shù)，然后綜合分析σB和σC蛋白的B細(xì)胞抗原表位。結(jié)果顯示σB蛋白B細(xì)胞表位可能在136～150、157～167及240～249區(qū)域或其附近，σC蛋白B細(xì)胞表位可能15～27、36～49、40～49及90～98區(qū)域或其附近，在這幾被預(yù)測(cè)的表位均含有β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。本研究為實(shí)驗(yàn)確定σB和σC蛋白