番鴨呼腸孤病毒病診斷技術(shù)研究.pdf

1、番鴨呼腸孤病毒病主要發(fā)生于番鴨,夏季多發(fā),發(fā)病日齡以4~45日齡為主,發(fā)病率達(dá)20％~90％,應(yīng)激或混合感染下,死亡率可達(dá)90％以上.國(guó)內(nèi)外未見有該病血清學(xué)診斷方法的報(bào)導(dǎo).因此,臨床上建立一種切實(shí)可行且快速的診斷方法越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)水禽養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)注.該研究以此為出發(fā)點(diǎn),建立了快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,而且能夠在基層應(yīng)用的間接ELISA檢測(cè)病毒抗體和反向乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)病毒抗原兩種血清學(xué)診斷方法.該課題以該實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存的番鴨呼腸孤病毒B3分離

2、株為研究材料,開展了番鴨呼腸孤病毒病間接ELISA和反向乳膠凝集試驗(yàn)兩種血清學(xué)診斷方法的研究與應(yīng)用工作.1.采用番鴨胚成纖維細(xì)胞成功的培養(yǎng)了番鴨呼腸孤病毒,感染細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的CPE病變,并進(jìn)行病毒的擴(kuò)大培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)二次差速離心和硫酸銨沉淀制備了所需的診斷抗原,病毒蛋白含量為5.628mg/ml.2.采用細(xì)胞培養(yǎng)的番鴨呼腸孤病毒,按所設(shè)定的免疫程序免疫成年公番鴨,獲得瓊擴(kuò)效價(jià)為1:16的陽(yáng)性血清,經(jīng)粗提和純化獲得了蛋白含量為4.2

3、42mg/ml的一抗IgG.同時(shí)采集健康番鴨的血清,純化后獲得IgG,按所設(shè)定的免疫程序免疫家兔,獲得瓊擴(kuò)效價(jià)為1:8的兔抗番鴨二抗血清,并純化得到蛋白含量為5.395mg/ml的二抗IgG.采用改良的過(guò)碘酸鈉法成功地把HRP標(biāo)記在純化的二抗IgG上,結(jié)果表明,酶結(jié)合率=0.5312,標(biāo)記率=0.6909,符合ELISA的要求.3.用硫酸銨粗提的番鴨呼腸孤病毒作為包被抗原和HRP酶標(biāo)記的兔抗番鴨二抗,成功地建立了檢測(cè)番鴨呼腸孤病毒病抗體

4、的間接ELISA法.試驗(yàn)結(jié)果表明,包被抗原1:80(0.0704mg/ml)稀釋,待檢血清1:40稀釋,酶標(biāo)二抗1:200稀釋,是該方法最佳的工作濃度.應(yīng)用研究結(jié)果表明,該法不與其它病原發(fā)生交叉反應(yīng),阻斷效果明顯,檢測(cè)番鴨呼腸孤病毒抗體可達(dá)1:800比瓊擴(kuò)試驗(yàn)高50倍,ELISA測(cè)定臨床采集的血清陽(yáng)性率達(dá)70％,瓊擴(kuò)試驗(yàn)陽(yáng)性率37.5％,兩者符合率67.5％,批內(nèi)批間重復(fù)結(jié)果穩(wěn)定.因此,間接ELISA法檢測(cè)番鴨呼腸病毒抗體特異性高、敏感

5、性強(qiáng)、重復(fù)性好、質(zhì)量穩(wěn)定、結(jié)果可靠,適合于臨床流行病調(diào)查.4.用純化的抗番鴨呼腸孤病毒抗體致敏乳膠成功地建立了反向乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)番鴨呼腸孤病毒抗原的方法.通過(guò)試驗(yàn),確定了抗體致敏乳膠的最佳濃度為0.4242 mg/ml,最佳致敏溫度37℃,最佳致敏時(shí)間2h.應(yīng)用研究結(jié)果表明,抗體致敏乳膠無(wú)自凝性,特異性強(qiáng),重復(fù)性好,質(zhì)量可靠.人工攻毒雛番鴨,用該方法可于攻毒后的第三天糞便中檢測(cè)到病毒抗原,直至攻毒鴨全部死亡都可從糞便中檢測(cè)到病毒,可見