番鴨呼腸孤病毒σC基因真核表達及其間接ELISA方法的建立.pdf

1、目的：通過探討番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck movims，MDRV)的分子生物學特性和免疫學特性，為建立番鴨呼腸孤病毒病的快速診斷方法提供科學的技術資料。 方法：根據番鴨呼腸孤病毒MW9710分離株序列設計了兩套PCR．引物，利用番鴨胚成纖維細胞增殖番鴨呼腸孤病毒，提取病毒基因組RNA，用反轉錄一聚合酶鏈式反應(RT-PCR)對MW9710株病毒oC基因片段進行擴增，連接pMD18-T載體測序驗證后，將產物克隆插入到

2、酵母表達載體pPIC9K中，轉化大腸桿菌DH5a中，挑取陽性克隆，獲得酵母表達重組質粒pPIC9K-σC。用SacI酶切線性化表達重組質粒pPIC9K-σC，電轉化至巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞內，經PCR鑒定和G418抗性篩選，獲得了5株pPIC9K-σC酵母陽性整合子，挑取1株進行甲醇誘導表達，SDS-PAGE檢測發(fā)現pPIC9K-σC酵母整合子經誘導表達后在酵母培養(yǎng)基上清中有明顯可見的目的蛋白條帶，分子量大小與預期相符合，而

3、未重組的酵母空載體中在經甲醇誘導表達后的上清中沒有相應的蛋白條帶，經檢測驗證表達量可達40mg/L。 結果：(1)成功構建番鴨呼腸孤病毒MW9710株σC基因巴斯德畢赤酵母表達體系。(2)證明了目的σC蛋白在巴斯德畢赤酵母中能夠有效地表達并大量分泌。(3)以番鴨呼腸孤病毒陽性血清為一抗和．AP酶標記的羊抗鴨IgG為二抗，通過Western Blot檢測表達產物σC蛋白的活性，表明了表達產物σC蛋白具有免疫活性。(4)通過間接EL