番鴨呼腸孤病毒σC基因真核表達(dá)及其間接ELISA方法的建立.pdf

1、目的：通過探討番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck movims，MDRV)的分子生物學(xué)特性和免疫學(xué)特性，為建立番鴨呼腸孤病毒病的快速診斷方法提供科學(xué)的技術(shù)資料。 方法：根據(jù)番鴨呼腸孤病毒MW9710分離株序列設(shè)計(jì)了兩套PCR．引物，利用番鴨胚成纖維細(xì)胞增殖番鴨呼腸孤病毒，提取病毒基因組RNA，用反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)對MW9710株病毒oC基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，連接pMD18-T載體測序驗(yàn)證后，將產(chǎn)物克隆插入到

2、酵母表達(dá)載體pPIC9K中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a中，挑取陽性克隆，獲得酵母表達(dá)重組質(zhì)粒pPIC9K-σC。用SacI酶切線性化表達(dá)重組質(zhì)粒pPIC9K-σC，電轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)PCR鑒定和G418抗性篩選，獲得了5株pPIC9K-σC酵母陽性整合子，挑取1株進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)pPIC9K-σC酵母整合子經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后在酵母培養(yǎng)基上清中有明顯可見的目的蛋白條帶，分子量大小與預(yù)期相符合，而

3、未重組的酵母空載體中在經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后的上清中沒有相應(yīng)的蛋白條帶，經(jīng)檢測驗(yàn)證表達(dá)量可達(dá)40mg/L。 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建番鴨呼腸孤病毒MW9710株σC基因巴斯德畢赤酵母表達(dá)體系。(2)證明了目的σC蛋白在巴斯德畢赤酵母中能夠有效地表達(dá)并大量分泌。(3)以番鴨呼腸孤病毒陽性血清為一抗和．AP酶標(biāo)記的羊抗鴨IgG為二抗，通過Western Blot檢測表達(dá)產(chǎn)物σC蛋白的活性，表明了表達(dá)產(chǎn)物σC蛋白具有免疫活性。(4)通過間接EL