禽呼腸孤病毒野毒株σC基因、抗原性及致病性比較研究.pdf

1、呼腸孤病毒(reovirus)是呼吸道腸道孤兒病毒(respiratory enteric orphan virus)的簡稱，可分為兩個主要的群，即哺乳動物來源呼腸孤病毒(MRV)和禽類來源呼腸孤病毒(ARV)。ARV屬于呼腸孤病毒科中的正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus genus)。ARV可引起多種疾病，常見的有病毒性關(guān)節(jié)炎/腱鞘炎、吸收障礙綜合征(MAS)、免疫抑制等。據(jù)報(bào)道ARV不同分離株的致病性差異很大，血清型多達(dá)10

2、個以上。雖然ARV在我國雞群中感染甚為普遍，但對．ARV分離株的致病性和抗原性方面很少有系統(tǒng)的研究報(bào)道。為了闡明ARV感染對我國養(yǎng)雞業(yè)的確切危害及其流行病學(xué)，本文對不同地區(qū)、表現(xiàn)不同臨床癥狀的不同類型的雞群分離到的ARV的抗原性關(guān)系、部分基因核酸序列和對雞的致病性作了比較研究。 1、10株ARV野毒株的分離、鑒定和純化為了研究我國禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ARV)流行毒株的致病性、抗原性及與抗原蛋白σC基因之間

3、的關(guān)系，利用細(xì)胞培養(yǎng)方法從山東、北京、大連、新疆、吉林、江蘇等不同省市患關(guān)節(jié)炎或(和)生長不良的雞場分離到10株ARV。并以間接熒光抗體試驗(yàn)和RT-PCR擴(kuò)增及序列分析的方法鑒定驗(yàn)證為禽呼腸孤病毒。其中7株來自患關(guān)節(jié)炎病雞，分別為DL、DF、LC、CHX、NT、LY、XJ株；兩株來自生長不良的肉雞，為ZZ、CC株;一株來自關(guān)節(jié)炎和生長不良同時存在的種雞，為YT株。上述病毒經(jīng)CEF傳代適應(yīng)后，經(jīng)無限稀釋法連續(xù)純化三次，以此純化的病毒作為致

4、病性和抗原性比較研究的病毒株。 2、不同分離株ARV σC基因序列與抗原性比較據(jù)報(bào)道，σC蛋白是ARV的抗原性蛋白。在本研究中，設(shè)計(jì)一對引物，用RT-PCR法擴(kuò)增CHX、LY、CC、DL、LC分離株中編碼σC蛋白的S1基因片斷，并克隆測序，結(jié)果顯示，這些ARV分離株編碼σC蛋白基因片段的同源性均在99％以上，其中CC、CHX和LY株的σC基因100％同源。 用經(jīng)純化的ARV分離株分別用SPF雞制備單因子血清，采用固定病毒

5、稀釋血清的方法在不同的毒株間進(jìn)行血清中和反應(yīng)，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)r值。結(jié)果顯示，ZZ、CC、CHX、LY、NT、XJ、S1133(疫苗株)的同源性均在25～74％之間，說明這些國內(nèi)不同區(qū)域分離的ARV野毒株雖然仍屬同一血清型，但抗原性已出現(xiàn)很大的差異。 從ARV野毒株σC基因片斷測序結(jié)果和病毒交叉中和試驗(yàn)結(jié)果比較表明，ARV血清中和反應(yīng)的抗原性并非僅僅與σC蛋白有關(guān)，有可能存在其它結(jié)構(gòu)蛋白與該病毒的免疫保護(hù)性有關(guān)。 3、不同

6、ARV株對SPF來航雞致病性比較研究 4、LY株．ARV對IBDV強(qiáng)毒致病性和疫苗免疫后抗體反應(yīng)的影響為進(jìn)一步研究ARV的致病性及與其它病毒相互間的作用，本研究選用LY株ARV進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。LY株ARV經(jīng)皮下注射感染1日齡SPF。來航雞，10<'5>TCID<,50>/只。結(jié)果顯示，LY株感染對SPF雞增重及7日齡AIV和NDV疫苗免疫后抗體滴度沒有顯著影響，但可引起法氏囊萎縮和淋巴細(xì)胞減少。LY株ARV感染1日齡SPF雞

7、后，30、52日齡時再分別用強(qiáng)毒株IBDV(GX株)攻擊。結(jié)果顯示，于30日齡攻擊IBDV強(qiáng)毒后，1日齡感染LY株ARV的試驗(yàn)組死亡率為20.8％(5/24)，顯著低于未感染ARV僅攻擊IBDV強(qiáng)毒對照組的58.3％(14/24)：于52日齡時，攻擊IBDV后，LY株ARV感染組死亡率為56.5％(13/23)，僅攻擊強(qiáng)毒IBDV的對照組為62.5％(15/24)，差異已經(jīng)不顯著。這表明，隨著日齡的增長，ARV感染引起的損傷有所恢復(fù)。A

8、RV對強(qiáng)毒株IBDV的這種致病性減低的影響可能由于ARV感染導(dǎo)致IBDV的靶細(xì)胞受損，影響了IBDV的繁殖所致。 用LY株ARV感染1日齡SPF雞，經(jīng)IBDV弱毒疫苗免疫后，誘發(fā)的抗體滴度為2303±1310，顯著低于對照組的3288±1451(P<0.01)；但對隨后IBDV強(qiáng)毒株攻毒的保護(hù)率卻與對照雞無顯著差異。經(jīng)IBDV弱毒疫苗免疫后，產(chǎn)生的抗體足以保護(hù)強(qiáng)毒株IBDV攻擊，不會引起死亡，但強(qiáng)毒攻擊仍能顯著抑制AIV、NDV

9、疫苗免疫后的抗體滴度。然而，對于1～7日齡經(jīng)ARV感染的雞，IBDV強(qiáng)毒的這種免疫抑制作用又顯著低于未經(jīng)ARV感染的對照雞，表明ARV感染可影響其他疾病的致病性。ARV感染與IBDV共感染的這種復(fù)雜性，極有可能是由于ARV感染對IBDV的靶細(xì)胞淋巴濾泡的損傷所致。 5、ARV對肉雞的致病性研究 6、用地高辛標(biāo)記的核酸探針檢測ARV在雞群中的傳播用地高辛標(biāo)記禽呼腸孤病毒(ARV)S1基因中編碼aC蛋白的基因片段作為核酸探針

10、，用以檢測組織中的ARV。核酸探針的敏感性和特異性結(jié)果顯示，該核酸探針特異性強(qiáng)，可檢測到1-6 pg的探針DNA。 利用所標(biāo)記的核酸探針，檢測了實(shí)驗(yàn)室感染CHX株ARV的雞羽毛囊及體內(nèi)不同組織病毒繁殖分布動態(tài)。結(jié)果顯示，ARV感染1日齡SPF雞，在24h時在大部分器官，如法氏囊、關(guān)節(jié)、脾臟、肝臟、肺臟、胸腺等器官中均能檢測到ARV。在4日齡時，在未接種ARV但同群飼養(yǎng)雞的相應(yīng)器官中亦檢測到ARV。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，在羽毛囊中的病毒

11、檢出率與雞內(nèi)臟器官中病毒的檢出率一致。這表明檢測羽毛囊中ARV可用于監(jiān)測ARV在雞群的流行狀態(tài)。用核酸探針檢測雞羽毛囊中ARV的方法檢測ARV的感染與流行情況，便于檢測大量樣品中的抗原，而且取樣不影響生產(chǎn)，具有實(shí)際應(yīng)用價值。 7．結(jié)語本研究在國內(nèi)首次對ARV的不同野毒株的σC基因、致病性和抗原性作了系統(tǒng)的比較研究。從我國不同地區(qū)不同病例分離到的ARV，在單獨(dú)人工感染時，均不易引起典型的臨床病理變化。不同野毒株的σC基因相對保守，