組織工程橋接管治療坐骨神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷是創(chuàng)傷外科的一種常見(jiàn)病、多發(fā)病。神經(jīng)損傷后致使支配區(qū)的感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)障礙，常常導(dǎo)致肌肉癱瘓、萎縮，甚至留下終生殘疾。目前對(duì)周圍神經(jīng)損傷尚無(wú)比較理想的治療方法。因此，從根本上促進(jìn)神經(jīng)纖維再生、重建神經(jīng)通路是創(chuàng)傷外科和康復(fù)醫(yī)學(xué)中的研究熱點(diǎn)。許多學(xué)者從多方面、用多種技術(shù)方法對(duì)周圍神經(jīng)損傷后的病理變化、再生狀況進(jìn)行了試驗(yàn)和檢測(cè)，例如對(duì)橫斷神經(jīng)兩斷端進(jìn)行套管橋接、局部應(yīng)用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等方法以修復(fù)損傷的神經(jīng)，雖然取得了不少成績(jī)，但仍未找到促

2、進(jìn)神經(jīng)再生、重建神經(jīng)通路的理想方法。 近來(lái)，組織工程技術(shù)的發(fā)展為周圍神經(jīng)損傷的治療開辟了新的思路，該項(xiàng)技術(shù)是利用生物可降解性材料結(jié)合種子細(xì)胞修復(fù)疾病或損傷的組織。將組織工程技術(shù)運(yùn)用于周圍神經(jīng)再生和修復(fù)中，是近年來(lái)創(chuàng)傷外科中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。生物可降解性支架材料和種子細(xì)胞的優(yōu)化精選是組織工程的關(guān)鍵。 殼聚糖是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的天然海洋類高分子化合物，具有多孔性、可降解吸收性及組織相容性強(qiáng)等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于組織工程支架材料。而單

3、一殼聚糖膜帶大量正電荷，對(duì)細(xì)胞粘附性過(guò)強(qiáng)，不利于細(xì)胞的增殖。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，具有良好的生物相容性及細(xì)胞粘附性，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和遷移有著重要的作用，而且對(duì)軸突再生也有重要的作用。但是，膠原單獨(dú)作為組織工程支架材料，強(qiáng)度上不盡如人意，且降解速度比較快，本實(shí)驗(yàn)將膠原與殼聚糖復(fù)合制作的支架材料，既可使殼聚糖的吸附能力有一定程度的下降，又可通過(guò)膠原和殼聚糖的交聯(lián)作用調(diào)節(jié)支架的降解速度。 雪旺細(xì)胞(Schwann cel

4、l，SCs)既可引導(dǎo)神經(jīng)軸索的定向生長(zhǎng)，又能分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)軸突的再生，是比較理想的種子細(xì)胞。然而自體來(lái)源的SCs難以大量獲得，且需二次手術(shù)：而異體來(lái)源的SCs則存在免疫排斥反應(yīng)等，因此有必要繼續(xù)尋找更為實(shí)用的種子細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)是一類具有自我更新及多潛能分化傾向的未分化細(xì)胞，可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，而且神經(jīng)干細(xì)胞免疫源性弱，可以誘導(dǎo)分化為雪旺細(xì)胞，是神經(jīng)組織工程的良好種

5、子細(xì)胞。神經(jīng)上皮干細(xì)胞起源于早期胚胎的神經(jīng)管和神經(jīng)板，是最原始的神經(jīng)干細(xì)胞，具有更活躍的增殖能力和很大的分化潛能，與神經(jīng)系統(tǒng)最具同源性，將神經(jīng)上皮干細(xì)胞應(yīng)用于神經(jīng)組織工程有著良好的應(yīng)用前景。目前將神經(jīng)上皮干細(xì)胞與膠原-殼聚糖制作組織工程橋接管用以修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的研究，尚未見(jiàn)報(bào)道。 基于以上理念，我們?cè)O(shè)計(jì)了本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)：用膠原蛋白和殼聚糖按3:1的比例采用冷凍干燥法制成膠原-殼聚糖支架材料；從孕11.5d Wistar大鼠的胚胎神經(jīng)

6、管分離神經(jīng)上皮干細(xì)胞并進(jìn)行體外擴(kuò)增；將神經(jīng)上皮干細(xì)胞種植在膠原-殼聚糖支架材料上，并應(yīng)用掃描電鏡觀察了神經(jīng)上皮干細(xì)胞在膠原-殼聚糖支架材料上的存活及生長(zhǎng)情況；應(yīng)用該組織工程導(dǎo)管橋接了缺損的大鼠坐骨神經(jīng)，術(shù)后進(jìn)行電生理、組織學(xué)、透射電鏡及逆行示蹤檢測(cè)，觀察了周圍神經(jīng)再生及神經(jīng)通路重建的狀況，以期為臨床修復(fù)周圍神經(jīng)損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 結(jié)果顯示，從神經(jīng)管取材的神經(jīng)上皮干細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)可以增殖并形成神經(jīng)球，nestin免疫細(xì)胞化學(xué)

7、染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，表明擴(kuò)增的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞；將神經(jīng)上皮干細(xì)胞接種在膠原-殼聚糖支架材料上行掃描電鏡觀察，可見(jiàn)神經(jīng)上皮干細(xì)胞貼附在膠原-殼聚糖材料表面，存活良好，表明神經(jīng)上皮干細(xì)胞與膠原-殼聚糖支架材料有良好的相容性；橋接手術(shù)后，電生理檢測(cè)結(jié)果顯示，含神經(jīng)上皮干細(xì)胞的膠原-殼聚糖導(dǎo)管橋接組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)潛速率及波幅值顯著好于單純膠原-殼聚糖導(dǎo)管橋接組(均P<0.01)；甲苯胺藍(lán)染色光鏡觀察及圖像分析結(jié)果均顯示，含神經(jīng)上皮干細(xì)胞的膠原-殼聚糖導(dǎo)

8、管橋接組再生軸突的髓鞘化更明顯，再生纖維密度及直徑等各檢測(cè)指標(biāo)均優(yōu)于單純膠原-殼聚糖導(dǎo)管橋接組(均P<0.01)。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，含神經(jīng)上皮干細(xì)胞的膠原-殼聚糖導(dǎo)管橋接組較單純膠原-殼聚糖導(dǎo)管橋接組再生纖維數(shù)目多，神經(jīng)纖維粗大，髓鞘厚；逆行神經(jīng)示蹤結(jié)果顯示，在脊髓灰質(zhì)前角中可檢測(cè)到熒光示蹤劑標(biāo)記的神經(jīng)元，含神經(jīng)上皮干細(xì)胞的膠原-殼聚糖導(dǎo)管橋接組標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于單純膠原-殼聚糖導(dǎo)管橋接組；BrdU和S-100免疫熒光雙染結(jié)果顯