槲皮素鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　槲皮素是一種廣泛分布于自然界的黃酮類化合物，約有100多種中草藥含有槲皮素。近年來對(duì)它的研究日益增多,發(fā)現(xiàn)其有多種藥理活性。其主要藥理活性包括：1.抗氧化及清除自由基的作用：電離輻射作用于機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量自由基,引起包括脂質(zhì)過氧化在內(nèi)的一系列自由基反應(yīng)。過剩的自由基是有害的,能夠?qū)е录?xì)胞結(jié)構(gòu)的改變和功能的破壞,甚至引起癌癥、衰老及心血管等許多疾病。實(shí)驗(yàn)證明,黃酮類化合物對(duì)超氧陰離子(O2-)、羥自由基(·OH)和單線態(tài)氧

2、(1O2)均有良好的清除作用。2.對(duì)心血管系統(tǒng)的作用：研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有降血壓、保護(hù)心肌缺血再灌注損傷等作用。近年來又發(fā)現(xiàn),槲皮素能顯著抑制血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖,對(duì)于肺動(dòng)脈高壓的防治具有重要作用。此外,槲皮素還有抗凝血作用。3.免疫調(diào)節(jié)作用：槲皮素能夠增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫機(jī)能有正向調(diào)節(jié)作用。4.抗癌作用：槲皮素對(duì)人卵巢癌、乳腺癌、白血病細(xì)胞、胃腸道腫瘤細(xì)胞均有增殖抑制作用。對(duì)細(xì)胞代謝情況的

3、影響和抗氧自由基對(duì)細(xì)胞的作用可能是其抗癌的一種機(jī)理。然而，關(guān)于槲皮素的鎮(zhèn)痛作用，相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道十分有限。龔珊等采用四種不同疼痛模型:熱板法、扭體反應(yīng)、電刺激-嘶叫法及福爾馬林法發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)不同性質(zhì)的疼痛:內(nèi)臟痛、軀體體表痛、相對(duì)性急性痛、緊張性的病理性疼痛均有鎮(zhèn)痛作用。對(duì)于其鎮(zhèn)痛機(jī)制的研究，尚無相關(guān)報(bào)道。由于槲皮素毒副作用小,越來越顯示出重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　國(guó)際疼痛協(xié)會(huì)將疼痛分為生理性痛和病理性痛。生理性痛是生存必需的警報(bào)系

4、統(tǒng)，病理性痛是妨礙生存的一種疾病。病理性痛在痛覺傳導(dǎo)路的各個(gè)水平，包括外周傷害性感受器、脊髓背角、脊髓上位傷害性感覺和情感神經(jīng)中樞和大腦皮質(zhì)等結(jié)構(gòu)，都可能發(fā)生了化學(xué)物質(zhì)和神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的改變或異常，如在外周組織或神經(jīng)損傷后產(chǎn)生傷害性感受器敏化、神經(jīng)損傷部位神經(jīng)瘤以及初級(jí)感覺神經(jīng)元發(fā)生異位放電、脊髓背角傷害性神經(jīng)元敏化、脊髓上位腦中樞異常激活或功能改變等，因此表現(xiàn)為：（1）持續(xù)性自發(fā)痛；（2）原發(fā)性和繼發(fā)性痛敏；（3）異常痛敏；（4）

5、伴有顯著組織炎癥癥狀、交感神經(jīng)功能異常癥狀和感覺神經(jīng)功能障礙?？傊±硇酝吹陌l(fā)生和持續(xù)慢性化過程可能累及整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能可塑性變化，因?yàn)橛醒装Y和交感神經(jīng)功能異常，所以在機(jī)制上也伴有神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)和多種因素的綜合作用。因?yàn)閱我坏膭?dòng)物模型不可能模擬所有的臨床病理性痛特點(diǎn)，且通過動(dòng)物模型模擬的現(xiàn)象與人類自身的臨床病理現(xiàn)象存在著一定的差異，因此在研究一個(gè)藥物的鎮(zhèn)痛效果時(shí)，需要聯(lián)合應(yīng)用各種痛模型展開研究才能全面客觀的評(píng)價(jià)藥物

6、療效，最終揭示病理性痛的機(jī)制，為臨床治療提供線索。
　　蜜蜂毒模型是近年來建立起來的一種新的實(shí)驗(yàn)病理性痛動(dòng)物模型。在清醒大鼠一側(cè)后足底注入蜜蜂毒溶液后，可以同時(shí)出現(xiàn)與臨床持續(xù)病理性痛癥狀相似的絕大多數(shù)傷害性感覺和痛敏表型，包括：1，以自發(fā)性縮足和舔足為表現(xiàn)形式的長(zhǎng)時(shí)程持續(xù)自發(fā)性傷害反應(yīng)（persistentspontaneousnociception,PSN）；2，注射側(cè)出現(xiàn)的原發(fā)性熱痛敏；3，注射側(cè)出現(xiàn)的原發(fā)性機(jī)械痛敏；4，非注

7、射側(cè)出現(xiàn)的繼發(fā)性（或稱作鏡像）熱痛敏。坐骨神經(jīng)分支損傷模型是Woolf及其同事在2000年介紹的一種神經(jīng)病理性痛模型，為了模擬臨床外周神經(jīng)損傷后的燒灼樣痛。該模型也有抬足、舔足等自發(fā)痛行為表現(xiàn)，但無自食傷肢行為，同時(shí)動(dòng)物損傷肢體有對(duì)輻射熱照射和CO2激光照射敏感的熱痛敏、對(duì)針刺（pin-prick）和vonFrey纖維刺激敏感的異常機(jī)械痛敏。該模型一般在手術(shù)后幾個(gè)小時(shí)出現(xiàn)痛相關(guān)行為，持續(xù)數(shù)月。
　　因而，本研究在模擬臨床病理性痛的

8、蜜蜂毒模型和坐骨神經(jīng)分支損傷模型上，采用口服給藥（灌胃）方法研究槲皮素的鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)口服槲皮素具有鎮(zhèn)痛作用且不能被納洛酮所翻轉(zhuǎn)，提示其鎮(zhèn)痛作用非阿片受體所介導(dǎo)。
　　方法：
　　槲皮素采用口服給藥（灌胃）方法，研究其對(duì)于蜜蜂毒模型和坐骨神經(jīng)分支損傷模型的痛相關(guān)行為的影響?？紤]到蜜蜂毒模型和坐骨神經(jīng)分支損傷模型痛相關(guān)行為出現(xiàn)的時(shí)間差別以及槲皮素的吸收和代謝過程，槲皮素的給藥時(shí)間點(diǎn)分別設(shè)置在蜜蜂毒注射前30分鐘（之前給藥）

9、，蜜蜂毒注射后3小時(shí)（之后給藥）和坐骨神經(jīng)分支損傷模型術(shù)后2周（此時(shí)痛敏已經(jīng)完全建立）。在灌胃給與大劑量槲皮素后，大鼠行ROTA-ROD試驗(yàn)以明確其在鎮(zhèn)痛作用的同時(shí)對(duì)運(yùn)動(dòng)平衡功能有無損害。在本研究中，均采用納洛酮作為一種非選擇性阿片受體拮抗劑來明確不同疼痛模型中，阿片受體在槲皮素鎮(zhèn)痛作用中的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　第一部分：槲皮素對(duì)大鼠生理狀態(tài)下熱和機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值的影響：
　　基礎(chǔ)值測(cè)定之前30分鐘給予槲皮素(4

10、0mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥對(duì)于熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期(PWTL)沒有顯著影響，但可以顯著提高機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值(PWMT)，并且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。
　　第二部分：槲皮素對(duì)蜜蜂毒模型痛相關(guān)行為的作用：
　　1、槲皮素對(duì)蜜蜂毒所致持續(xù)自發(fā)傷害性反應(yīng)的作用
　　皮下注射蜜蜂毒之前30分鐘給予槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥劑量依賴地抑制蜜蜂毒所致的自發(fā)縮足

11、反應(yīng)，這種抑制作用從給藥后30分鐘開始，延續(xù)至整個(gè)觀察時(shí)程（60分鐘）。槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥劑量依賴地抑制蜜蜂毒所致的痛級(jí)評(píng)分，這種抑制作用從給藥后50分鐘開始，，延續(xù)至整個(gè)觀察時(shí)程（60分鐘）。
　　2、槲皮素對(duì)蜜蜂毒所致熱痛敏和機(jī)械痛敏的作用
　　皮下注射蜜蜂毒之前30分鐘給予槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥可以抑制蜜蜂毒所致的熱痛敏和機(jī)械痛

12、敏。皮下注射蜜蜂毒之后3小時(shí)給予槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥劑量依賴地抑制蜜蜂毒所致的熱痛敏和機(jī)械痛敏。
　　3、槲皮素對(duì)蜜蜂毒注射局部炎癥的作用
　　皮下注射蜜蜂毒之前30分鐘給予槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥可以抑制蜜蜂毒所致的爪體積增大，這種抑制作用在蜜蜂毒注射后8小時(shí)作用明顯，相當(dāng)于吲哚美辛（2.5mg/kg）的抑制作用。然而，皮下注射蜜蜂毒之

13、后3小時(shí)給予槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥對(duì)于蜜蜂毒所致的爪體積增大沒有顯著的抑制作用（僅在蜜蜂毒注射后8小時(shí)，槲皮素(120mg/kg)具有一定的抑制作用）。
　　4、槲皮素對(duì)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能的影響
　　與對(duì)照組相比較，槲皮素（80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥在T4，以及槲皮素（120mg/kg)灌胃給藥在T5的跑臺(tái)時(shí)間顯著延長(zhǎng)。
　　5、納洛酮對(duì)槲皮素鎮(zhèn)痛作用的影響

14、　　在皮下注射蜜蜂毒之后3小時(shí)給予非選擇性阿片受體拮抗劑納洛酮(2mg/kg)腹腔注射和槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)納洛酮對(duì)于槲皮素的鎮(zhèn)痛作用（熱痛敏和機(jī)械痛敏）沒有翻轉(zhuǎn)作用，提示槲皮素的鎮(zhèn)痛作用（熱痛敏和機(jī)械痛敏）非阿片受體所介導(dǎo)。
　　第三部分：槲皮素對(duì)坐骨神經(jīng)分支損傷模型痛相關(guān)行為的作用：
　　1、坐骨神經(jīng)分支損傷模型痛相關(guān)行為的觀察
　　SNI模型術(shù)后，腓腸神經(jīng)支

15、配區(qū)很快出現(xiàn)機(jī)械性痛敏，機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值由術(shù)前的14.98±5.46g降低至5.38±2.40g(術(shù)后一天)。對(duì)于所有觀察的8只手術(shù)組動(dòng)物，穩(wěn)定的機(jī)械性痛敏在術(shù)后2周建立起來（機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值為1.44±0.42g），并維持整個(gè)觀察時(shí)程（5個(gè)月）。從觀察的第7天開始，手術(shù)對(duì)側(cè)的機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值也顯著降低，這種對(duì)側(cè)的機(jī)械性痛敏維持達(dá)50天，并在觀察的第100天完全恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。
　　2、槲皮素對(duì)坐骨神經(jīng)分支損傷模型機(jī)械

16、性異常痛敏和對(duì)側(cè)機(jī)械痛敏的作用：
　　與對(duì)照組相比較，槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥可以劑量依賴地抑制坐骨神經(jīng)分支損傷模型的機(jī)械性異常痛敏，以及對(duì)側(cè)出現(xiàn)的機(jī)械性痛敏。槲皮素(120mg/kg)可以在給藥后20分鐘將同側(cè)的機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值提高5.11±2.63％(p<0.05)，作用持續(xù)240分鐘；將對(duì)側(cè)的機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值提高8.64±5.42％(p<0.01)，作用持續(xù)300分鐘。

17、>　　3、納洛酮對(duì)槲皮素鎮(zhèn)痛作用的影響
　　在槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥之前或者之后15分鐘給予非選擇性阿片受體拮抗劑納洛酮（2mg/kg）腹腔注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)納洛酮對(duì)于槲皮素的鎮(zhèn)痛作用（同側(cè)的機(jī)械性異常通敏和對(duì)側(cè)的機(jī)械性痛敏）沒有翻轉(zhuǎn)作用，提示槲皮素的鎮(zhèn)痛作用（同側(cè)的機(jī)械性異常通敏和對(duì)側(cè)的機(jī)械性痛敏）非阿片受體所介導(dǎo)。
　　結(jié)論：
　　1.生理狀態(tài)下，槲皮素對(duì)于熱刺激縮足反應(yīng)潛伏

18、期(PWTL)沒有顯著影響，但可以顯著提高機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值(PWMT)，并且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，作用類似于嗎啡。
　　2.槲皮素對(duì)于蜜蜂毒所致的自發(fā)傷害性反應(yīng)，痛級(jí)評(píng)分，熱痛敏和機(jī)械痛敏均有顯著的抑制作用，并且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。無論從作用時(shí)程還是作用強(qiáng)度進(jìn)行比較，槲皮素對(duì)于蜜蜂毒所致的機(jī)械痛敏的抑制作用強(qiáng)于其對(duì)于熱痛敏的抑制作用。提示槲皮素對(duì)于熱痛敏和機(jī)械痛敏的鎮(zhèn)痛作用的作用機(jī)制不完全相同。
　　3.槲皮素對(duì)于

19、蜜蜂毒所致的局部炎癥反應(yīng)有顯著的抑制作用，并且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，作用類似于吲哚美辛，提示槲皮素的鎮(zhèn)痛作用可能與對(duì)促炎性因子的阻斷相關(guān)。
　　4.較大劑量的槲皮素（80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥可以顯著延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能檢測(cè)中動(dòng)物在rotarod上的停留時(shí)間，提示該藥可以增強(qiáng)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)平衡能力。
　　5.槲皮素對(duì)于坐骨神經(jīng)分支損傷模型所致的同側(cè)的機(jī)械性異常痛敏和對(duì)側(cè)的機(jī)械性痛敏均有顯著的抑制作用，并且呈現(xiàn)出一定