槲皮素鎮(zhèn)痛作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　槲皮素是一種廣泛分布于自然界的黃酮類化合物，約有100多種中草藥含有槲皮素。近年來對它的研究日益增多,發(fā)現(xiàn)其有多種藥理活性。其主要藥理活性包括：1.抗氧化及清除自由基的作用：電離輻射作用于機體會產(chǎn)生大量自由基,引起包括脂質(zhì)過氧化在內(nèi)的一系列自由基反應(yīng)。過剩的自由基是有害的,能夠?qū)е录毎Y(jié)構(gòu)的改變和功能的破壞,甚至引起癌癥、衰老及心血管等許多疾病。實驗證明,黃酮類化合物對超氧陰離子(O2-)、羥自由基(·OH)和單線態(tài)氧

2、(1O2)均有良好的清除作用。2.對心血管系統(tǒng)的作用：研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有降血壓、保護心肌缺血再灌注損傷等作用。近年來又發(fā)現(xiàn),槲皮素能顯著抑制血小板衍生生長因子(PDGF)誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細胞增殖,對于肺動脈高壓的防治具有重要作用。此外,槲皮素還有抗凝血作用。3.免疫調(diào)節(jié)作用：槲皮素能夠增強細胞免疫功能，對機體細胞免疫機能有正向調(diào)節(jié)作用。4.抗癌作用：槲皮素對人卵巢癌、乳腺癌、白血病細胞、胃腸道腫瘤細胞均有增殖抑制作用。對細胞代謝情況的

3、影響和抗氧自由基對細胞的作用可能是其抗癌的一種機理。然而，關(guān)于槲皮素的鎮(zhèn)痛作用，相關(guān)的文獻報道十分有限。龔珊等采用四種不同疼痛模型:熱板法、扭體反應(yīng)、電刺激-嘶叫法及福爾馬林法發(fā)現(xiàn)槲皮素對不同性質(zhì)的疼痛:內(nèi)臟痛、軀體體表痛、相對性急性痛、緊張性的病理性疼痛均有鎮(zhèn)痛作用。對于其鎮(zhèn)痛機制的研究，尚無相關(guān)報道。由于槲皮素毒副作用小,越來越顯示出重要的臨床應(yīng)用價值。
　　國際疼痛協(xié)會將疼痛分為生理性痛和病理性痛。生理性痛是生存必需的警報系

4、統(tǒng)，病理性痛是妨礙生存的一種疾病。病理性痛在痛覺傳導(dǎo)路的各個水平，包括外周傷害性感受器、脊髓背角、脊髓上位傷害性感覺和情感神經(jīng)中樞和大腦皮質(zhì)等結(jié)構(gòu)，都可能發(fā)生了化學(xué)物質(zhì)和神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的改變或異常，如在外周組織或神經(jīng)損傷后產(chǎn)生傷害性感受器敏化、神經(jīng)損傷部位神經(jīng)瘤以及初級感覺神經(jīng)元發(fā)生異位放電、脊髓背角傷害性神經(jīng)元敏化、脊髓上位腦中樞異常激活或功能改變等，因此表現(xiàn)為：（1）持續(xù)性自發(fā)痛；（2）原發(fā)性和繼發(fā)性痛敏；（3）異常痛敏；（4）

5、伴有顯著組織炎癥癥狀、交感神經(jīng)功能異常癥狀和感覺神經(jīng)功能障礙?？傊?，病理性痛的發(fā)生和持續(xù)慢性化過程可能累及整個神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能可塑性變化，因為有炎癥和交感神經(jīng)功能異常，所以在機制上也伴有神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)和多種因素的綜合作用。因為單一的動物模型不可能模擬所有的臨床病理性痛特點，且通過動物模型模擬的現(xiàn)象與人類自身的臨床病理現(xiàn)象存在著一定的差異，因此在研究一個藥物的鎮(zhèn)痛效果時，需要聯(lián)合應(yīng)用各種痛模型展開研究才能全面客觀的評價藥物

6、療效，最終揭示病理性痛的機制，為臨床治療提供線索。
　　蜜蜂毒模型是近年來建立起來的一種新的實驗病理性痛動物模型。在清醒大鼠一側(cè)后足底注入蜜蜂毒溶液后，可以同時出現(xiàn)與臨床持續(xù)病理性痛癥狀相似的絕大多數(shù)傷害性感覺和痛敏表型，包括：1，以自發(fā)性縮足和舔足為表現(xiàn)形式的長時程持續(xù)自發(fā)性傷害反應(yīng)（persistentspontaneousnociception,PSN）；2，注射側(cè)出現(xiàn)的原發(fā)性熱痛敏；3，注射側(cè)出現(xiàn)的原發(fā)性機械痛敏；4，非注

7、射側(cè)出現(xiàn)的繼發(fā)性（或稱作鏡像）熱痛敏。坐骨神經(jīng)分支損傷模型是Woolf及其同事在2000年介紹的一種神經(jīng)病理性痛模型，為了模擬臨床外周神經(jīng)損傷后的燒灼樣痛。該模型也有抬足、舔足等自發(fā)痛行為表現(xiàn)，但無自食傷肢行為，同時動物損傷肢體有對輻射熱照射和CO2激光照射敏感的熱痛敏、對針刺（pin-prick）和vonFrey纖維刺激敏感的異常機械痛敏。該模型一般在手術(shù)后幾個小時出現(xiàn)痛相關(guān)行為，持續(xù)數(shù)月。
　　因而，本研究在模擬臨床病理性痛的

8、蜜蜂毒模型和坐骨神經(jīng)分支損傷模型上，采用口服給藥（灌胃）方法研究槲皮素的鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)口服槲皮素具有鎮(zhèn)痛作用且不能被納洛酮所翻轉(zhuǎn)，提示其鎮(zhèn)痛作用非阿片受體所介導(dǎo)。
　　方法：
　　槲皮素采用口服給藥（灌胃）方法，研究其對于蜜蜂毒模型和坐骨神經(jīng)分支損傷模型的痛相關(guān)行為的影響?？紤]到蜜蜂毒模型和坐骨神經(jīng)分支損傷模型痛相關(guān)行為出現(xiàn)的時間差別以及槲皮素的吸收和代謝過程，槲皮素的給藥時間點分別設(shè)置在蜜蜂毒注射前30分鐘（之前給藥）

9、，蜜蜂毒注射后3小時（之后給藥）和坐骨神經(jīng)分支損傷模型術(shù)后2周（此時痛敏已經(jīng)完全建立）。在灌胃給與大劑量槲皮素后，大鼠行ROTA-ROD試驗以明確其在鎮(zhèn)痛作用的同時對運動平衡功能有無損害。在本研究中，均采用納洛酮作為一種非選擇性阿片受體拮抗劑來明確不同疼痛模型中，阿片受體在槲皮素鎮(zhèn)痛作用中的機制。
　　結(jié)果：
　　第一部分：槲皮素對大鼠生理狀態(tài)下熱和機械刺激縮足反應(yīng)閾值的影響：
　　基礎(chǔ)值測定之前30分鐘給予槲皮素(4

10、0mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥對于熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期(PWTL)沒有顯著影響，但可以顯著提高機械刺激縮足反應(yīng)閾值(PWMT)，并且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。
　　第二部分：槲皮素對蜜蜂毒模型痛相關(guān)行為的作用：
　　1、槲皮素對蜜蜂毒所致持續(xù)自發(fā)傷害性反應(yīng)的作用
　　皮下注射蜜蜂毒之前30分鐘給予槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥劑量依賴地抑制蜜蜂毒所致的自發(fā)縮足

11、反應(yīng)，這種抑制作用從給藥后30分鐘開始，延續(xù)至整個觀察時程（60分鐘）。槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥劑量依賴地抑制蜜蜂毒所致的痛級評分，這種抑制作用從給藥后50分鐘開始，，延續(xù)至整個觀察時程（60分鐘）。
　　2、槲皮素對蜜蜂毒所致熱痛敏和機械痛敏的作用
　　皮下注射蜜蜂毒之前30分鐘給予槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥可以抑制蜜蜂毒所致的熱痛敏和機械痛

12、敏。皮下注射蜜蜂毒之后3小時給予槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥劑量依賴地抑制蜜蜂毒所致的熱痛敏和機械痛敏。
　　3、槲皮素對蜜蜂毒注射局部炎癥的作用
　　皮下注射蜜蜂毒之前30分鐘給予槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥可以抑制蜜蜂毒所致的爪體積增大，這種抑制作用在蜜蜂毒注射后8小時作用明顯，相當(dāng)于吲哚美辛（2.5mg/kg）的抑制作用。然而，皮下注射蜜蜂毒之

13、后3小時給予槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥對于蜜蜂毒所致的爪體積增大沒有顯著的抑制作用（僅在蜜蜂毒注射后8小時，槲皮素(120mg/kg)具有一定的抑制作用）。
　　4、槲皮素對運動協(xié)調(diào)功能的影響
　　與對照組相比較，槲皮素（80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥在T4，以及槲皮素（120mg/kg)灌胃給藥在T5的跑臺時間顯著延長。
　　5、納洛酮對槲皮素鎮(zhèn)痛作用的影響

14、　　在皮下注射蜜蜂毒之后3小時給予非選擇性阿片受體拮抗劑納洛酮(2mg/kg)腹腔注射和槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)納洛酮對于槲皮素的鎮(zhèn)痛作用（熱痛敏和機械痛敏）沒有翻轉(zhuǎn)作用，提示槲皮素的鎮(zhèn)痛作用（熱痛敏和機械痛敏）非阿片受體所介導(dǎo)。
　　第三部分：槲皮素對坐骨神經(jīng)分支損傷模型痛相關(guān)行為的作用：
　　1、坐骨神經(jīng)分支損傷模型痛相關(guān)行為的觀察
　　SNI模型術(shù)后，腓腸神經(jīng)支

15、配區(qū)很快出現(xiàn)機械性痛敏，機械刺激縮足反應(yīng)閾值由術(shù)前的14.98±5.46g降低至5.38±2.40g(術(shù)后一天)。對于所有觀察的8只手術(shù)組動物，穩(wěn)定的機械性痛敏在術(shù)后2周建立起來（機械刺激縮足反應(yīng)閾值為1.44±0.42g），并維持整個觀察時程（5個月）。從觀察的第7天開始，手術(shù)對側(cè)的機械刺激縮足反應(yīng)閾值也顯著降低，這種對側(cè)的機械性痛敏維持達50天，并在觀察的第100天完全恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。
　　2、槲皮素對坐骨神經(jīng)分支損傷模型機械

16、性異常痛敏和對側(cè)機械痛敏的作用：
　　與對照組相比較，槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥可以劑量依賴地抑制坐骨神經(jīng)分支損傷模型的機械性異常痛敏，以及對側(cè)出現(xiàn)的機械性痛敏。槲皮素(120mg/kg)可以在給藥后20分鐘將同側(cè)的機械刺激縮足反應(yīng)閾值提高5.11±2.63％(p<0.05)，作用持續(xù)240分鐘；將對側(cè)的機械刺激縮足反應(yīng)閾值提高8.64±5.42％(p<0.01)，作用持續(xù)300分鐘。

17、>　　3、納洛酮對槲皮素鎮(zhèn)痛作用的影響
　　在槲皮素(40mg/kg,80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥之前或者之后15分鐘給予非選擇性阿片受體拮抗劑納洛酮（2mg/kg）腹腔注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)納洛酮對于槲皮素的鎮(zhèn)痛作用（同側(cè)的機械性異常通敏和對側(cè)的機械性痛敏）沒有翻轉(zhuǎn)作用，提示槲皮素的鎮(zhèn)痛作用（同側(cè)的機械性異常通敏和對側(cè)的機械性痛敏）非阿片受體所介導(dǎo)。
　　結(jié)論：
　　1.生理狀態(tài)下，槲皮素對于熱刺激縮足反應(yīng)潛伏

18、期(PWTL)沒有顯著影響，但可以顯著提高機械刺激縮足反應(yīng)閾值(PWMT)，并且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，作用類似于嗎啡。
　　2.槲皮素對于蜜蜂毒所致的自發(fā)傷害性反應(yīng)，痛級評分，熱痛敏和機械痛敏均有顯著的抑制作用，并且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。無論從作用時程還是作用強度進行比較，槲皮素對于蜜蜂毒所致的機械痛敏的抑制作用強于其對于熱痛敏的抑制作用。提示槲皮素對于熱痛敏和機械痛敏的鎮(zhèn)痛作用的作用機制不完全相同。
　　3.槲皮素對于

19、蜜蜂毒所致的局部炎癥反應(yīng)有顯著的抑制作用，并且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，作用類似于吲哚美辛，提示槲皮素的鎮(zhèn)痛作用可能與對促炎性因子的阻斷相關(guān)。
　　4.較大劑量的槲皮素（80mg/kg和120mg/kg)灌胃給藥可以顯著延長運動協(xié)調(diào)功能檢測中動物在rotarod上的停留時間，提示該藥可以增強動物的運動平衡能力。
　　5.槲皮素對于坐骨神經(jīng)分支損傷模型所致的同側(cè)的機械性異常痛敏和對側(cè)的機械性痛敏均有顯著的抑制作用，并且呈現(xiàn)出一定