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文檔簡介
1、胰島移植是治療糖尿病的有效手段之一。胰島移植安全、可靠,并發(fā)癥少,它不僅可以有效降低血糖,而且可以減緩、防止甚至逆轉糖尿病慢性血管病變,在很大程度上改善病人依靠胰島素治療不能糾正的免疫缺損狀況。但是移植后急性排斥反應嚴重影響移植胰島的功能,如何預防和控制排斥反應的發(fā)生、發(fā)展,仍是亟待解決的問題。趨化因子是一類控制免疫細胞定向遷移的細胞因子,對白細胞的發(fā)育、分化、定位具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究顯示趨化因子及其受體介導的細胞免疫在急性排斥反應
2、中具有重要作用。肽核酸是一種核酸類似物,它是由2氨基乙基甘氨酸蛋白骨架取代核酸的磷酸戊糖,可以高度特異地與所選基因序列的靶點結合。肽核酸能高親和性、高特異性地與DNA或RNA雜交形成穩(wěn)定雙螺旋或三螺旋結構。本實驗擬應用反義肽核酸阻斷CC趨化因子受體5(CCR5)和CXC趨化因子受體3(CXCR3)作用途徑,研究其對同種異體胰島移植急性排斥反應的影響及其作用機制。 材料和方法:實驗動物采用昆明小鼠(沈陽藥科大學動物中心提供)作為供
3、體,體重(30±2)g,雌雄不限,受者為C57小鼠,體重(30±2)g。 糖尿病小鼠模型制備:移植前14天,采用鏈脲霉素化學灼傷法制備糖尿病小鼠模型(腹腔內(nèi)注射2%STZ,150mg/kg體重)。監(jiān)測隨機血糖,如連續(xù)3天在非禁食情況下,血糖>16.8mmol/L,即為糖尿病模型。 胰島分離純化:采用明尼蘇達大學改良方法,原位灌注消化、密度梯度分離純化胰島。應用含冷卻的膠原酶(膠原酶V型,1.5mgml)的Hank’s緩沖
4、液2-4ml灌注胰腺,切取胰腺。37℃水浴消化12-15min。低溫(8℃,800rpm,2min)清洗細胞2次。采用密度梯度離心純化胰島,介質濃度分別為25%、23%、20.5%、11%Ficoll。 胰島移植模型建立:倒置顯微鏡下手檢計數(shù)300當量胰島(1當量相當于1個直徑100μm以上胰島)。10μl長吸頭移液器管嘴吸取胰島,將細胞離心(1000rpm,3min)至尖端吸頭處。糖尿病小鼠經(jīng)右側脊柱旁切口暴露右側腎臟。于右腎
5、下極被膜處作一長約2mm的切口,緩慢將移液器中的胰島推入。 實驗一:根據(jù)不同處理因素將胰島移植受者隨機分4組:生理鹽水組;CCR5反義肽核酸組(序列:5’-Tyr-CCGTTCTGACTTTT-Lys-3’421);CXCR3反義肽核酸組(序列:8845’-Tyr-ACGTGGCTTTTTCG-Lys3’871);隨機肽核酸組(序列:Tyr-TTTCCAGCTGCTTT-Lys)。反義肽核酸從術日起至術后第6天,每日經(jīng)尾靜脈注射
6、,劑量為2.5mg/kg。生理鹽水組每日注射0.1ml生理鹽水。移植后監(jiān)測非空腹血糖,低于11.2mmol/1,作為移植物存活的標準。移植后非空腹血糖連續(xù)2天高于11.2mmol/1,以第一時間作為移植物受排斥、功能喪失的指標。判斷移植物存活時間。排斥反應時或術后第7天切取5只小鼠含有胰島移植物的部分腎臟、脾臟、血液標本進行檢測。提取移植物RNA和蛋白,半定量分析CCR5、CXCR3及相應配體mRNA水平和CCR5、CXCR3蛋白水平。
7、同時留取正常小鼠腎臟檢測CCR5、CXCR3mRNA水平。制備脾細胞懸液,應用雙色流式細胞分析技術檢測T淋巴細胞CCR5、CXCR3的表達。采用微量全血3H-TdR摻入法檢測T淋巴細胞增殖能力。同時,移植物標本進行HE染色及Insulin免疫組化染色,觀察組織形態(tài)學改變。 實驗二:根據(jù)不同處理因素胰島移植受體隨機分3組:生理鹽水組:每日尾靜脈注射0.1ml生理鹽水;CCR5反義肽核酸(PNACCR5)組:術日起至術后第6天,每日
8、經(jīng)尾靜脈注射,劑量為2.5mg/kg;CCR5反義肽核酸聯(lián)合應用低劑量雷帕霉素組:除應用PNACCR5外,同時采用管飼法于術日至術后第6天,每日給予低劑量雷帕霉素(0.2mg/kg)。移植后監(jiān)測非空腹血糖,低于11.2mmol/L,作為移植物存活的標準。移植后非空腹血糖連續(xù)2天高于11.2mmol/L,以第一時間作為移植物受排斥、功能喪失的指標。判斷移植物存活時間。排斥反應時或術后第7天共留取5只小鼠含有胰島移植物的部分腎臟、脾臟、血液
9、標本進行檢測。提取移植物RNA和蛋白,監(jiān)測IL-2、IFN-γIL-10mRNA水平和CCR5蛋白水平。采用微量全血3H-TdR摻入法檢測T淋巴細胞增殖能力。同時,移植物標本進行HE染色及Insulin免疫組化染色,觀察組織形態(tài)學改變。 所有數(shù)據(jù)以(x)±s表示,采用One-WayANOVA方法檢驗。胰島移植物生存時間應用Kaplan-Meier生存曲線分析,采用Log-rank進行檢驗。P<0.05認為有統(tǒng)計學意義,所有數(shù)據(jù)均
10、通過SPSS10.0軟件處理。 結果實驗一:生理鹽水組胰島移植2天后血糖有所下降,但之后再次升高,移植物平均存活時間(6.50±0.58)天。PNACCP5組小鼠于胰島移植后3天空腹血糖恢復正常,移植胰島平均存活時間(12.00±1.75)天。PNACX-CR3組、隨機PNA組移植物平均存活時間分別為(9.70±1.000天、(6.50±0.50)天。PNACCR5組和PNACXCR3組移植物平均存活時間明顯長于生理鹽水組和隨機
11、PNA組,差異顯著。PNACCR5組和PNACXCR3組相比,移植物存活時間無明顯差別(P>0.05)。正常小鼠CCR5mRNA低水平表達,發(fā)生排斥反應時相對表達量顯著升高為1.83±0.09,兩組比較差異顯著(P<0.01)。正常小鼠CXCR3mRNA低水平表達,排斥反應時升高。術后第7天或急性排斥反應時檢測移植物內(nèi)CCR5、CXCR3及其配體mR-NA表達,PNACCR5組CCR5mRNA水平明顯下調(diào),同生理鹽水對照組和隨機PNA組
12、比較,差異顯著(P<0.01)。PNACXCR3組CXCR3mRNA水平明顯下調(diào),同生理鹽水對照組和隨機PNA組比較,差異顯著(P<0.01)。PNACCR5組和PNACXCR3組,RANTES、MIP-1α、IP-10和Mig水平較對照組無明顯降低。WesternBlotting結果顯示PNACCR5明顯且特異地降低CCR5蛋白分泌,同生理鹽水組和隨機PNA組比較,差異顯著(P<0.01)。PNACXCR3中度下調(diào)CXCR3蛋白表達。
13、PNACCR5組脾CD3+T細胞CCR5表達率明顯下降,表達率0.32±0.03,PNACXCR3組脾CD3+T細胞CXCR3表達率下降。檢測術后第7天受者淋巴細胞增殖能力,各組間無統(tǒng)計學差別(P>0.05)。生理鹽水組和隨機PNA組HE染色胰島移植物周圍可見大量淋巴細胞浸潤,Insulin染色著色淺。PNACCR5和PNACXCR3組小鼠腎被膜下胰島移植物周圍淋巴細胞浸潤少見,Insulin免疫組化染成棕黃色,證實確為有功能的胰島。
14、 實驗二:生理鹽水對照組、PNACCR5組和PNACCR5聯(lián)合應用低劑量雷帕霉素組移植胰島存活時間分別為(6.50±0.58)天,(12.00±1.75)天,(16.20±3.13)天。聯(lián)合應用組與單獨PNACCR5組相比,存活時間明顯延長(P<0.05)。與對照組相比,單獨PNACCR5組和聯(lián)合治療組IFN-γmRNA表達水平降低(P<0.01)。單獨PNACCR5組和聯(lián)合治療組比較,兩者無差別(P>0.05);聯(lián)合應用組和PN
15、ACCR5組IL-2mRNA水平均較對照組降低,差異顯著(P<0.01);聯(lián)合應用組IL-10mRNA水平較PNACCR5組升高,差異明顯(P<0.01)。顯示雷帕霉素與PNACCR5有協(xié)同作用,并使同種異體胰島移植受者細胞因子分泌格局從Th1型向Th2型細胞因子轉化。絲裂原刺激的淋巴細胞增殖反應顯示,聯(lián)合應用組淋巴細胞增殖能力降低,同PNACCR5組和生理鹽水組比較,均有統(tǒng)計學差異(P<0.01,P<0.05)。PNACCR5和聯(lián)合應
16、用組小鼠腎被膜下區(qū)增厚,胰島移植物周圍淋巴細胞浸潤少見,Insulin免疫組化染成棕黃色,證實確為有功能的胰島。 結論1.CCR5和CXCR3反義肽核酸能夠特異、顯著的降低移植物CCR5、CXCR3mRNA表達和蛋白分泌。 2.CCR5和CXCR3反義肽核酸下調(diào)CD3+T淋巴細胞CCR5、CXCR3的表達,抑制淋巴細胞活化,但對淋巴細胞增殖能力無明顯影響。 3.CCR5和CXCR3反義肽核酸能夠延長同種異體胰島移
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