外周血單個核細胞趨化因子受體CXCR3 mRNA表達與大鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)的關(guān)系.pdf

1、同種異體心臟移植術(shù)已經(jīng)成為終末期心臟病理想的治療手段，隨著各種新型免疫抑制藥物不斷出現(xiàn)、移植手術(shù)和心肌保護技術(shù)不斷提高，心臟移植術(shù)后．患者存活時間明顯延長，生活質(zhì)量顯著改善。盡管如此，移植術(shù)后急、慢性排斥反應(yīng)和移植物血管病仍然是制約心臟移植術(shù)后患者長期生存的主要原因之一，其內(nèi)在機制尚未完全清楚。近年來，大量動物實驗及臨床研究已經(jīng)證明，趨化因子(Chemokine，CK)及其受體在介導(dǎo)抗原提呈、淋巴細胞活化的第一信號及第二信號通路、淋巴細

2、胞毒性效應(yīng)過程等方面發(fā)揮了重要作用?；蛐酒夹g(shù)的發(fā)明給這個領(lǐng)域的研究提供了極大的方便，國內(nèi)外這方面的研究進展很快，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多基因在排斥反應(yīng)時移植物中可以檢測出明顯的上調(diào)或者下調(diào)，趨化因子受體(ChemokineReceptor，CKR)中CXCR3和CCR5是起主要作用，而其他一些趨化因子受體比如CCRl、CCR2則作用不是十分顯著。但是，外周血單個核細胞(PeripheralBloodMononeuclearCell，PBMC

3、)的表面趨化因子受體CXCR3是否與排斥反應(yīng)具有相關(guān)性，這方面的報道較少。 本研究成功建立了大鼠腹部異位心臟移植模型，采用實時定量PCR技術(shù)動態(tài)觀察了大鼠心臟移植術(shù)后PBMC的CXCR3mRNA表達情況，采用免疫組織化學(xué)分析方法研究了CXCR3在移植心心肌組織中的定位；并通過動態(tài)觀察大鼠心臟移植術(shù)后外周血CD4+／CD8+T淋巴細胞比值變化、外周血血清中細胞因子IL一10、IL一2、IFN-Y和TNF-Q的動態(tài)變化，初步探討PB

4、MC表面的趨化因子受體CXCR3參與大鼠心臟移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的作用機制，評估PBMC的CXCR3mRNA表達在監(jiān)測和判斷心臟移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)中可能的應(yīng)用價值。整個實驗共分以下三個部分。 第一部分 非工作型和工作型大鼠腹部異位心臟移植模型的建立及比較 目的:建立非工作型和工作型大鼠腹部異位心臟移植模型，并比較其優(yōu)缺點。 方法:20只健康雄性wistar大鼠作為供體，20只健康雄性SD大鼠作為受體，均

5、為清潔級。供心獲取方法基本相同，與受體的吻合略有差異：非工作型心臟移植模型供心升主動脈與受體腹主動脈端側(cè)吻合，供心肺動脈與受體下腔靜脈端側(cè)吻合；工作型心臟移植模型先行供心肺動脈與左心耳吻合，然后供心升主動脈與受體腹主動脈端側(cè)吻合。觀察比較手術(shù)各步驟時間、術(shù)后一般情況、移植心存活時間和心臟超聲心動圖檢查等。 結(jié)果：非工作型和工作型心臟移植模型手術(shù)成功率分別為100％和90％，30s內(nèi)移植心復(fù)跳率1.00％。 結(jié)論：非工作型

6、心臟移植模型的建立技巧較成熟，可以單人獨立完成操作，適合于心臟移植術(shù)后短期觀察急性排斥反應(yīng)的移植免疫學(xué)方面研究；工作型心臟移植模型有左、右心室作功，更適合于移植術(shù)后長期觀察慢性排斥反應(yīng)和移植物血管病等方面的研究，但缺點是需兩人合作才能完成手術(shù)操作，且手術(shù)難度較大。 第二部分外周血單個核細胞CXCR3mRNA表達與大鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)的關(guān)系 目的:探討外周血單個核細胞CXCR3mRNA動態(tài)變化與大鼠心臟移植術(shù)后急性排斥

7、反應(yīng)的關(guān)系及其在早期診斷中的價值。 方法：以Wistar和SD大鼠作為供體，SD大鼠作為受體，建立非工作型腹部異位心臟移植模型，按移植前后處理方法不同隨機分3組：A組為SD大鼠同基因移植對照組，移植前后未作處理；B組為Wistar-SD急性排斥組，移植前后未作處理；C組為wistar—SD異基因移植治療組，移植日開始給予環(huán)胞素A(CsA)5mg／Kg／d腹腔注射×14天。術(shù)后第l、3、5、7天分批處死，采用實時定量PCR檢測移植

8、心心肌和PBMC的CXCR3mRNA表達，采用免疫組織化學(xué)方法分析CXCR3在移植心心肌組織中的定位，并對移植心肌進行病理組織學(xué)檢查，每組留8只用于觀察生存期。． 結(jié)果：A組大鼠移植心存活時間均大于lOOd，B、C組分別為(7．40±L14)d、(24．00±2．35)d，C組較B組存活時間明顯延長(；KO．01)，A組較B、C組存活時間更長(P(O．01)。A組各時間點均未發(fā)生排斥反應(yīng)，移植心心肌和PBMC的CXCR3mRNA

9、呈低水平表達；B組術(shù)后移植心心肌和PBMC的CXCR3mRNA動態(tài)變化與急性排斥反應(yīng)的進程均呈正相關(guān)，術(shù)后5d心肌和PBMC的CXCR3mRNA表達上調(diào)至峰值，分別為(2．30±0．72)、(4．30±0．82)；C組經(jīng)環(huán)胞素A治療后排斥反應(yīng)發(fā)生率明顯下降，各時間點移植心心肌和PBMC的CXCR3mRNA表達明顯低于B組，術(shù)后7d達到峰值(1．2l±0．77)、(L50±O．76)，與B組相比均有顯著性差異(P(O．01)。CXCR3定

10、位于移植心心肌組織內(nèi)浸潤的T淋巴細胞表面，其配體之一CXCLIO定位于移植心血管內(nèi)皮細胞和心肌間質(zhì)。 結(jié)論：移植心心肌和PBMC的CXCR3mRNA表達與術(shù)后急性排斥反應(yīng)進程密切相關(guān)，提示可作為診斷急性排斥反應(yīng)或者觀察抗排斥反應(yīng)療效的指標。 第三部分CXCR3參與大鼠心臟移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)機制的初步研究 目的:觀察大鼠心臟移植術(shù)后外周血細胞因子IL-10、IL-2、IFN—γ和TNF-Q及CD4+／CD8+T淋

11、巴細胞的動態(tài)變化，初步探討PBMC的趨化因子受體CXCR3參與急性排斥反應(yīng)的機制。 方法:以wistar和SD大鼠作為供體，sD大鼠作為受體，建立非工作型腹部異位心臟移植模型，按移植前后處理方法不同隨機分3組：A組為SD大鼠間同品系移植對照組，移植前后未作處理；B組為wistar-SD急性排斥組，移植前后未作處理；C組為wistar-SD異基因移植治療組，移植日開始給予環(huán)胞素A(CsA)5mg／Kg／d腹腔注射×14天。術(shù)后第1

12、、3、5、7天分批處死，采用ELISA法檢測外周血血清的IL-10、IL一2、IFN—y和TNF-Q的表達水平，采用流式細胞儀對外周血中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞計數(shù)，對心肌進行病理組織學(xué)檢查。 結(jié)果:A組術(shù)后CD3+T淋巴細胞計數(shù)和CD4+／CD8+比值與正常大鼠相比無顯著差異，B組隨著急性排斥反應(yīng)進程出現(xiàn)CD3+T淋巴細胞的增高和CD4+／CD8+比值的上升，術(shù)后5d達到峰值分別為70．17％±4．04％和2．3

13、8±0．35，C組經(jīng)環(huán)胞素A治療后上述指標各時間點均出現(xiàn)明顯下降，術(shù)后5d分別為54．67％±3．95％和L46±0．19(KO．01)。A組細胞因子IL-10、IL-2、IFN-Y和TNF-Q與正常大鼠相比，均無顯著差異；B組術(shù)后出現(xiàn)IL-10表達水平的短暫上升，術(shù)后5d達到峰值(61．4l±2．29)pg／mL，術(shù)后7d出現(xiàn)迅速下降，C組經(jīng)環(huán)胞素A治療后，IL-10呈緩慢上升趨勢，與A、B兩組相比差異具有顯著性；B組術(shù)后IL-2、I

14、FN-Y和TNF-Q水平與排斥反應(yīng)具有相關(guān)性，均在術(shù)后5d達到高峰，C組經(jīng)治療后上述細胞因子表達水平均明顯下降，B、C兩組間有顯著差異(P