多重實(shí)時(shí)PCR對(duì)宮頸癌及癌前病變HPV-16病毒整合狀態(tài)的檢測(cè).pdf

1、背景HPV感染與宮頸癌及癌前病變發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，高危型HPV病毒整合入宿主細(xì)胞是細(xì)胞轉(zhuǎn)化及癌變的關(guān)鍵。高危型HPV病毒整合狀態(tài)的檢測(cè)對(duì)深入探討宮頸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制及預(yù)測(cè)宮頸病變的轉(zhuǎn)歸有著重要意義。然而目前尚沒(méi)有一種理想的HPV病毒存在狀態(tài)的檢測(cè)方法。由于所應(yīng)用的方法不同，宮頸癌及癌前病變中高危型HPV整合狀況的研究結(jié)果報(bào)道不一。 目的為建立理想的HPV存在狀態(tài)檢測(cè)方法，了解宮頸癌及癌前病變HPV-16DNA的整合狀況，初步探討H

2、PV-16DNA整合在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及HPV-16整合狀態(tài)檢測(cè)可能具有的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法以HPV-16質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，利用兩種不同的熒光報(bào)告基團(tuán)采用多重實(shí)時(shí)PCR同時(shí)檢測(cè)HPV-16E2和E6基因，應(yīng)用外標(biāo)曲線法進(jìn)行E2、E6基因的定量，根據(jù)E2和E6相對(duì)含量來(lái)判定HPV-16DNA的存在狀態(tài)；對(duì)HPV-16陽(yáng)性的宮頸癌SiHa細(xì)胞株和27例宮頸鱗癌新鮮標(biāo)本進(jìn)行多重實(shí)時(shí)PCR與Southern雜交檢測(cè)，對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行比較；應(yīng)

3、用多重實(shí)時(shí)PCR對(duì)HPV-16陽(yáng)性的5l例宮頸鱗癌和49例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變石蠟標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，了解宮頸癌及癌前病變HPV-16DNA的整合狀況。結(jié)果1.采用多重實(shí)時(shí)PCR所得到的HPV-16E2、E6標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性好，相關(guān)系數(shù)均為1.00，擴(kuò)增效率均在95％以上。 2.對(duì)系列稀釋濃度的HPV-16質(zhì)粒進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，確定了E2/E6比值為1時(shí)該多重實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)的95％參考值范圍為0.81～1.29，以0.81作為區(qū)分HPV

4、-16純游離狀態(tài)和混合狀態(tài)的界值。 3.多重實(shí)時(shí)PCR與Southern雜交檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)SiHa細(xì)胞株中HPV-16病毒呈整合狀態(tài)，兩種檢測(cè)方法對(duì)22例鱗癌HPV-16存在狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果相一致，符合率為81.5％，有著較高的一致性(Kappa值為0.844，P＜0.001)。 4.不同程度宮頸病變HPV-16病毒存在狀態(tài)有差異(P＜0.001)：CINⅠ中HPV-16大多以游離方式存在，但仍有整合的發(fā)生(42.9％)；CIN

5、Ⅱ和CINⅢ中HPV-16大多以混合狀態(tài)存在(＞70％)；而浸潤(rùn)癌中HPV-16主要整合入宿主細(xì)胞(68.6％)，很少以游離形式存在(9.8％)。 5.HPV-16整合發(fā)生率與不同程度的宮頸病變有關(guān)(P=0.002)，并且隨著宮頸病變級(jí)別的升高呈上升趨勢(shì)(42.9％、76.5％、83.3％、90.2％)。 6.HPV-16病毒存在狀態(tài)在早期(Ⅰ期)和晚期(Ⅱ期+Ⅲ期)鱗癌間有顯著差異(P＜0.001)，Ⅱ+Ⅲ期(88％)

6、宮頸癌中純整合狀態(tài)HPV-16所占比例顯著高于Ⅰ期(33.3％)宮頸癌。HPV-16存在狀態(tài)在不同的病理分級(jí)、不同病灶大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和宮旁轉(zhuǎn)移等狀況之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論1.多重實(shí)時(shí)定量PCR是一種可靠的檢測(cè)HPV-16病毒存在狀態(tài)的方法，具有準(zhǔn)確、省時(shí)、簡(jiǎn)便快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)，并且能用于石蠟以及病灶較小、DNA含量少的宮頸癌前病變組織或?qū)m頸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本。2.HPV-16整合是宮頸癌變的早期事件。3.HPV-