SLC-CCR7信號(hào)軸在肝癌免疫微環(huán)境中的作用機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是一種進(jìn)展迅速，預(yù)后很差的惡性腫瘤，其中約90％是肝細(xì)胞癌（以下稱肝癌，hepatocellular carcinoma，HCC），在世界范圍內(nèi)是第3位癌癥死因，在中國(guó)是第2位癌癥死因，60％-80％的就診患者均為中晚期，僅能接受姑息性治療，而且肝癌無敏感化療藥物，更容易出現(xiàn)治療后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。因此，肝癌的免疫生物學(xué)治療(immunotherapy)被認(rèn)為是治療肝癌的有效手段，將為改善預(yù)后發(fā)揮重要作用。

2、　　免疫治療是通過人為方式對(duì)腫瘤患者的免疫系統(tǒng)進(jìn)行主動(dòng)或者被動(dòng)干預(yù)，調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)，清除腫瘤細(xì)胞從而實(shí)現(xiàn)治療目的。在HCC中，免疫治療具有較好的治療效果，其中，以SLC(secondary lymphoid-tissue chemokine，SLC/CCL21)為基礎(chǔ)的免疫治療顯示出很好的抗腫瘤效應(yīng)。SLC是由內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，活化的T細(xì)胞等分泌的趨化因子，通過與趨化因子受體CCR7結(jié)合，引起細(xì)胞發(fā)生遷移等變

3、化，對(duì)樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)，T細(xì)胞等各種免疫細(xì)胞的趨化與歸巢發(fā)揮了重要作用。在HCC荷瘤小鼠的腫瘤局部高表達(dá)SLC，腫瘤內(nèi)CD4+，CD8十T細(xì)胞和DCs大量浸潤(rùn)，腫瘤生長(zhǎng)得到明顯抑制。
　　在SLC趨化募集的免疫細(xì)胞中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)和DCs對(duì)HCC免疫微環(huán)境具有關(guān)鍵作用。Tregs是HCC免疫微環(huán)境中發(fā)揮免疫抑制的關(guān)鍵細(xì)胞，由不同亞群構(gòu)成，其中最

4、主要的是CD4+ CD25+ Foxp3+的T細(xì)胞亞群。Tregs激活后，可以通過與其他免疫細(xì)胞直接接觸或者以通過分泌抑制性細(xì)胞因子，對(duì)其他免疫細(xì)胞發(fā)揮抑制作用，維持腫瘤內(nèi)免疫抑制微環(huán)境。在HCC患者外周血，腫瘤組織及癌旁組織Tregs數(shù)量明顯上升，并且抑制功能增強(qiáng)，與臨床預(yù)后呈顯著的負(fù)相關(guān);以anti-CD25單克隆抗體輸注，減少Tregs數(shù)量后，腫瘤特異性的CD4+和CD8+T細(xì)胞激活則明顯提高，取得了較好的抗腫瘤效應(yīng)，表明減少HC

5、C的Tregs是改善HCC環(huán)境中免疫抑制的重要途徑。
　　SLC-CCR7信號(hào)對(duì)Tregs的趨化作用是其在體內(nèi)發(fā)揮功能的重要前提，此外，CCR7信號(hào)激活還能明顯影響T細(xì)胞的其他功能。CCR7信號(hào)激活，可以阻止T細(xì)胞增殖，保護(hù)T細(xì)胞抵抗凋亡;更關(guān)鍵的是，CCR7可以作為重要的共刺激信號(hào)，輔助CD4+T細(xì)胞激活及分泌IL-2和IL-4。因此，CCR7在Tregs中也很有可能作為共刺激分子，產(chǎn)生共刺激信號(hào)，影響Tregs的功能。而Tre

6、gs功能本身則受到Foxp3-microRNAs(Foxp3-miRNAs)網(wǎng)絡(luò)的密切調(diào)控，所以，SLC-CCR7提供的共刺激信號(hào)極有可能在Tregs中協(xié)同F(xiàn)oxp3-miRNAs網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)Tregs抑制功能。
　　DCs由骨髓來源的前體細(xì)胞分化成熟，可以分為髓樣DCs(myeloid DCs)和淋巴樣DCs(plasmacytoid DCs)，是最重要的抗原遞呈細(xì)胞，在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其功能狀態(tài)很大程度上決定

7、了免疫應(yīng)答的最終效應(yīng)。肝癌免疫微環(huán)境中的成熟DCs數(shù)量減少，不成熟DCs數(shù)量增加，是誘導(dǎo)并維持HCC免疫耐受的重要因素。DCs數(shù)量及功能改變，顯著影響HCC患者的預(yù)后。SLC則對(duì)DCs成熟及功能具有明顯影響，在體外培養(yǎng)的DCs中加入SLC，可以有效誘導(dǎo)DCs成熟和增殖，伴隨增強(qiáng)的抗原遞呈能力;同時(shí)，在腫瘤組織高表達(dá)SLC同樣能誘導(dǎo)瘤內(nèi)DCs成熟。因此，SLC介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)與其誘導(dǎo)DCs成熟與增殖密不可分。然而，SLC-CCR7誘導(dǎo)DC

8、s成熟與增殖的分子機(jī)制尚不清楚。
　　為了進(jìn)一步探索在HCC中以SLC為基礎(chǔ)的免疫治療方案，提高治療效果，并從分子水平闡明SLC-CCR7信號(hào)軸對(duì)Tregs和DCs的作用機(jī)制，本課題將從以下三個(gè)方面進(jìn)行研究:1、在HCC瘤內(nèi)注射SLC并聯(lián)合anti-CD25 mAbs，檢驗(yàn)該治療方案其是否可以發(fā)揮更好的抗腫瘤效應(yīng);2、以Hepa1-6肝細(xì)胞癌致敏的Tregs分析SLC-CCR7信號(hào)軸與Foxp3-miRNAs網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系及其對(duì)Tre

9、gs的影響;3、以體外實(shí)驗(yàn)分析SLC-CCR7信號(hào)軸促進(jìn)DCs成熟與增殖的分子機(jī)制。
　　主要研究方法和內(nèi)容：
　　1.采用瘤內(nèi)注射SLC并聯(lián)合anti-CD25 mAbs對(duì)Hepa1-6皮下荷瘤小鼠進(jìn)行治療，以免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)分析治療后瘤內(nèi)Tregs，CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞和CD11c+ DCs動(dòng)態(tài)變化，采用ELISA檢測(cè)治療后第5天瘤內(nèi)細(xì)胞因子IL-10，TGF-β1，IFN-γ及IL-12含量。
　　

10、2.采用免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)態(tài)分析不同治療組外周淋巴結(jié)，脾和肝組織內(nèi)Tregs，CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞數(shù)量變化，以腫瘤體積和質(zhì)量的變化曲線作為指標(biāo)分析治療效果。
　　3.免疫磁珠分選Hepa1-6致敏的Tregs，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)Tregs純度檢驗(yàn)，然后以小鼠miRCURYTM LNA Array(v.16.0)芯片檢測(cè)，以火山圖(volcano plots)方法篩選差異表達(dá)的miRNAs，熒光定量PCR驗(yàn)證，隨后以HCC患

11、者外周血Tregs進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證，確定HCC致敏的Tregs中差異表達(dá)的miNRAs。
　　4.體外培養(yǎng)Hepa1-6致敏的Tregs/對(duì)照Tregs，轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的小干擾RNA對(duì)Foxp3進(jìn)行沉默，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后以熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)干擾效率進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)合microRNAs芯片分析干擾前后顯著變化的miRNAs，尋找Foxp3特異性調(diào)節(jié)的miNRAs。
　　5.采用TargetScan Mouse對(duì)Tregs差異表達(dá)

12、miRNAs的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，以生物信息學(xué)軟件EGAN分析Foxp3-miRNAs網(wǎng)絡(luò)與SLC-CCR7信號(hào)軸是否存在串話，結(jié)合GEO芯片數(shù)據(jù)庫以基因集富集分析(GSEA)方法對(duì)可能存在的串話進(jìn)行檢驗(yàn)。
　　6.體外培養(yǎng)BMDCs，以SLC/ELC刺激12，24小時(shí)，結(jié)合小鼠G Protein-coupledReceptors Signaling PathwayFinder Gene Array芯片基因分析下游顯著激活的信號(hào)通路，

13、并以Western blot進(jìn)行驗(yàn)證，探討CCR7信號(hào)誘導(dǎo)BMDCs成熟和增殖的分子機(jī)制。
　　主要結(jié)果：
　　1.瘤內(nèi)注射治療后，SLC顯著降低瘤內(nèi)Tregs數(shù)量，SLC和anti-CD25聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)一步減少Tregs，使其始終維持在最低水平。治療后第5天，治療組瘤內(nèi)CD4+，CD8+T細(xì)胞和CD11c+DCs數(shù)量顯著增加，anti-CD25 mAbs協(xié)同SLC進(jìn)一步增加CD8+T細(xì)胞的數(shù)量;SLC組瘤內(nèi)的IL-12含量明

14、顯增加，IL-10和TGF-β1明顯減少，anti-CD25 mAbs能夠與SLC發(fā)揮有效協(xié)同作用，使IFN-γ發(fā)生顯著增加。
　　2.治療組淋巴結(jié)內(nèi)Tregs含量顯著低于Control組;聯(lián)合anti-CD25 mAbs進(jìn)一步顯著降低Tregs含量（第7、9天）。治療后第3天起，治療組CD8+和CD4+T細(xì)胞數(shù)量更高;anti-CD25 mAbs能夠顯著增加CD8+T細(xì)胞數(shù)量（第3、5天）及CD4+T細(xì)胞數(shù)量（第5天）。

15、　　3.治療組脾組織內(nèi)Tregs數(shù)量顯著低于Control組，SLC聯(lián)合anti-CD25 mAbs使Tregs數(shù)量維持最低（第3-9天）。SLC顯著增加CD8+T細(xì)胞數(shù)量（第5、7、9天），anti-CD25 mAbs進(jìn)一步發(fā)揮顯著協(xié)同作用。SLC聯(lián)合anti-CD25 mAbs組顯著增加CD4+T細(xì)胞，SLC組僅在第5，7，9天顯著增加CD4+T細(xì)胞。
　　4.治療后肝組織內(nèi)，治療組Tregs數(shù)量低于Control組，CD8+

16、和CD4+T細(xì)胞數(shù)量高于Control組。SLC組有顯著增加的CD8+T細(xì)胞數(shù)量，聯(lián)合anti-CD25 mAbs進(jìn)一步增加CD8+T細(xì)胞數(shù)量（第1、3、9天）。Control組CD4+T細(xì)胞數(shù)量始終處于最低水平，SLC組始終處于最高。
　　5.Control組腫瘤體積持續(xù)快速增長(zhǎng)，SLC可明顯抑制腫瘤增長(zhǎng)，anti-CD25 mAbs在治療后第5天開始發(fā)揮有效協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)SLC抑制作用。Control組腫瘤重量持續(xù)快速增加，S

17、LC顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)（第7、9天），SLC聯(lián)合anti-CD25從治療后第3天起顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。
　　6.Hepal-6致敏的Tregs中5個(gè)miRNAs明顯上調(diào)(mmu-miR-487b-5p，mmu-miR-709, mmu-miR-182-5p, mmu-miR-214-3p和mmu-miR-467a-3p),4個(gè)miRNAs明顯下調(diào)(mmu-miR-142-5p，mmu-miR-30b-5p，mmu-miR-409-3p

18、和mmu-miR-129-5p)，其中Foxp3干擾后mmu-miR-214-3p，mmu-miR-30b-5p顯著下調(diào)，mmu-miR-409-3p顯著上調(diào);HCC患者外周血Tregs中，hsa-miR-182-5p，hsa-miR-214-3p，hsa-miR-129-5p和hsa-miR-30b-5p顯著上調(diào)。
　　7.SLC-CCR7下游信號(hào)蛋白與調(diào)節(jié)IL-10，TGF-β1，IFN-γ及IL-12的基因集有明顯的關(guān)聯(lián)?；?/p>

19、因集富集分析(GSEA)證明調(diào)節(jié)TGF-β1和IL-10的基因在腫瘤致敏的Tregs顯著富集;Foxp3-miRNAs網(wǎng)絡(luò)與SLC-CCR7信號(hào)軸存在串話，調(diào)節(jié)IL-10，TGF-β1，IFN-γ及IL-12。
　　8.SLC/ELC刺激12、24小時(shí)，BMDCs核內(nèi)磷酸化p65維持在較高水平并且伴隨胞漿p65持續(xù)低水平，但ELC的效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于SLC，PDTC可以完全阻滯SLC/ELC誘導(dǎo)p65磷酸化;Cyclin D1，E1，E

20、2和p21的表達(dá)在刺激后持續(xù)維持在較高水平，E2F-1和E2F-2表達(dá)沒有顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1.HCC瘤內(nèi)注射SLC并聯(lián)合anti-CD25 mAbs可以有效改善腫瘤免疫微環(huán)境，減少其中Tregs數(shù)量，降低IL-10和TGF-β1水平，增加CD8+，CD4+T細(xì)胞數(shù)量和CD11c+DCs，提高IFN-γ及IL-12水平;同時(shí)可以對(duì)宿主淋巴結(jié)、脾和肝這些外周免疫器官產(chǎn)生系統(tǒng)性優(yōu)化，減少Tregs數(shù)量，優(yōu)化CD8+，C

21、D4+T細(xì)胞數(shù)量，能夠?qū)崿F(xiàn)更好抗腫瘤效應(yīng)。
　　2.HCC致敏的Tregs出現(xiàn)特征性miRNAs表達(dá)譜差，9個(gè)miRNAs呈現(xiàn)差異性表達(dá)，其中4個(gè)miRNAs(hsa-miR-182-5p，hsa-miR-214-3p，hsa-miR-129-5p和hsa-miR-30b-5p)在HCC患者外周血Tregs中顯著上調(diào);小鼠Tregs中Foxp3特異性調(diào)節(jié)mmu-miR-214-3p，mmu-miR-30b-5p和mmu-miR-4