微泡microRNAs在肝癌診斷及發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、第一部分 SMMC-7721細(xì)胞及其來(lái)源微泡中microRNA表達(dá)譜的比較及生物信息學(xué)分析
　　目的:比較人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721及其來(lái)源微泡(microvesicles,MVs)中的微小RNA(microRNA,miRNA)表達(dá)譜,探明微泡能否作為細(xì)胞的縮影,并分析微泡miRNAs在肝癌微環(huán)境中的作用。
　　方法:培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞,分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)液并分離培養(yǎng)液中微泡。分別提取細(xì)胞及微泡中總RNA,進(jìn)行A

2、glient miRNA芯片分析。對(duì)篩選出的目標(biāo)miRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)分析,包括靶基因預(yù)測(cè),基因本體論和信號(hào)通路注釋。
　　結(jié)果:在檢測(cè)的888個(gè)miRNAs中,一共檢出284個(gè)miRNAs,其中細(xì)胞和微泡共同表達(dá)148個(gè)miRNAs,15個(gè)miRNAs僅在細(xì)胞中出現(xiàn),121個(gè)miRNAs僅在MVs中出現(xiàn)。即細(xì)胞中檢測(cè)到的miRNAs絕大部分(90.8％)出現(xiàn)在微泡中。對(duì)表達(dá)水平相近的48個(gè)miRNAs進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn),在38

3、31個(gè)靶基因中,有78個(gè)癌癥相關(guān)基因,占已公布癌癥相關(guān)基因的16.5％;基因本體論注釋發(fā)現(xiàn)在生物過(guò)程亞類(lèi)中富集的主要是細(xì)胞死亡和粘附子類(lèi);信號(hào)通路注釋發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集在與腫瘤,細(xì)胞周期與凋亡,免疫反應(yīng),細(xì)胞粘附及代謝相關(guān)的信號(hào)通路。
　　結(jié)論:微泡可以充分反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)miRNA特征。SMMC-7721細(xì)胞系來(lái)源微泡中miRNAs的功能與腫瘤密切相關(guān)。
　　第二部分肝癌患者與正常人外周血來(lái)源微泡中microRNA表達(dá)譜的比較及

4、生物信息學(xué)分析
　　目的:比較肝癌患者與正常人外周血來(lái)源微泡(microvesicles,MVs)中微小RNA(microRNA,miRNA)表達(dá)譜,探討腫瘤循環(huán)微泡中有無(wú)miRNA的異常表達(dá),為肝癌診斷提供生物學(xué)標(biāo)志。
　　方法:收集肝癌患者及正常人外周血的血漿,分離微泡并提取微泡中總RNA,進(jìn)行miRNA微陣列芯片檢測(cè)。對(duì)異常表達(dá)miRNAs進(jìn)行深入的生物信息學(xué)分析,包括多數(shù)據(jù)庫(kù)靶基因分析,蛋白質(zhì)相互作用分析,基因本體論

5、注釋,單個(gè)miRNA信號(hào)通路的嚴(yán)格預(yù)測(cè)。
　　結(jié)果:肝癌患者與正常人外周血微泡中共檢出460個(gè)miRNAs,其中肝癌組檢出385個(gè)miRNAs,對(duì)照組檢出456個(gè)miRNAs,其中共同表達(dá)381個(gè)miRNAs,4個(gè)miRNAs僅在肝癌組出現(xiàn),75個(gè)miRNAs僅在對(duì)照組出現(xiàn)。與對(duì)照組相比,肝癌組有242個(gè)miRNAs明顯差異表達(dá)。其中115個(gè)miRNAs表達(dá)顯著增高,倍數(shù)變化值最高31(hsa-miR-671-5p),127個(gè)mi

6、RNAs表達(dá)顯著降低,倍數(shù)變化值最低0.041(hsa-miR-432)。對(duì)表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的前10名miRNAs分別進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),NOL3和SRRM1分別在上調(diào)組300個(gè)靶基因和下調(diào)組219個(gè)靶基因的編碼蛋白質(zhì)的相互作用中具有相對(duì)核心地位。信號(hào)通路注釋顯示下調(diào)組hsa-miR-323-3p,hsa-miR-381和hsa-miR-495顯著參與了腫瘤,細(xì)胞粘附和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)通路,如MAPK信號(hào)通路,Wnt信號(hào)通路,慢性髓系白血

7、病信號(hào)通路,細(xì)胞粘附分子信號(hào)通路,抗原加工和呈遞信號(hào)通路。
　　結(jié)論:肝癌患者外周血來(lái)源微泡中miRNA的表達(dá)與正常對(duì)照明顯不同,miRNA的種類(lèi)減少以及表達(dá)水平下降。肝癌患者外周血來(lái)源微泡中異常表達(dá)的miRNAs可能通過(guò)微泡介導(dǎo)的細(xì)胞間信息交流作用參與了肝癌進(jìn)展。
　　第三部分肝病患者與正常人外周血來(lái)源微泡中microRNA表達(dá)譜的比較與分析
　　目的:通過(guò)比較慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化及肝癌患者外周血微泡(micr

8、ovesicles,MVs)中微小RNA(microRNA,miRNA)表達(dá)譜,開(kāi)發(fā)臨床非侵入性監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)志并探討微泡中miRNAs在慢性乙型病毒性肝炎-肝硬化-肝癌這一疾病轉(zhuǎn)歸過(guò)程中的作用。
　　方法:收集正常健康人及慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化及肝癌患者外周血的血漿并分離微泡。提取各組微泡中總RNA并行質(zhì)檢后進(jìn)行miRNA微陣列芯片雜交,洗片,掃描,信號(hào)數(shù)字轉(zhuǎn)化及數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:與正常人相比,

9、慢性乙型病毒性肝炎,肝硬化及肝癌患者外周血來(lái)源微泡中miRNA的表達(dá)譜有明顯不同。肝炎組共有378個(gè)miRNAs異常表達(dá),其中156個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào),222個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào);肝硬化組共有121個(gè)miRNAs異常表達(dá),其中64個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào),57個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào);肝癌組共242個(gè)miRNAs表達(dá)異常,其中115個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào),127個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),46個(gè)miRNAs在肝炎、肝硬化及