微泡microRNAs在肝癌診斷及發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、第一部分 SMMC-7721細胞及其來源微泡中microRNA表達譜的比較及生物信息學分析
　　目的:比較人肝癌細胞系SMMC-7721及其來源微泡(microvesicles,MVs)中的微小RNA(microRNA,miRNA)表達譜,探明微泡能否作為細胞的縮影,并分析微泡miRNAs在肝癌微環(huán)境中的作用。
　　方法:培養(yǎng)SMMC-7721細胞,分別收集細胞和培養(yǎng)液并分離培養(yǎng)液中微泡。分別提取細胞及微泡中總RNA,進行A

2、glient miRNA芯片分析。對篩選出的目標miRNAs進行生物信息學分析,包括靶基因預測,基因本體論和信號通路注釋。
　　結(jié)果:在檢測的888個miRNAs中,一共檢出284個miRNAs,其中細胞和微泡共同表達148個miRNAs,15個miRNAs僅在細胞中出現(xiàn),121個miRNAs僅在MVs中出現(xiàn)。即細胞中檢測到的miRNAs絕大部分(90.8％)出現(xiàn)在微泡中。對表達水平相近的48個miRNAs進行功能分析發(fā)現(xiàn),在38

3、31個靶基因中,有78個癌癥相關(guān)基因,占已公布癌癥相關(guān)基因的16.5％;基因本體論注釋發(fā)現(xiàn)在生物過程亞類中富集的主要是細胞死亡和粘附子類;信號通路注釋發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集在與腫瘤,細胞周期與凋亡,免疫反應,細胞粘附及代謝相關(guān)的信號通路。
　　結(jié)論:微泡可以充分反應細胞內(nèi)miRNA特征。SMMC-7721細胞系來源微泡中miRNAs的功能與腫瘤密切相關(guān)。
　　第二部分肝癌患者與正常人外周血來源微泡中microRNA表達譜的比較及

4、生物信息學分析
　　目的:比較肝癌患者與正常人外周血來源微泡(microvesicles,MVs)中微小RNA(microRNA,miRNA)表達譜,探討腫瘤循環(huán)微泡中有無miRNA的異常表達,為肝癌診斷提供生物學標志。
　　方法:收集肝癌患者及正常人外周血的血漿,分離微泡并提取微泡中總RNA,進行miRNA微陣列芯片檢測。對異常表達miRNAs進行深入的生物信息學分析,包括多數(shù)據(jù)庫靶基因分析,蛋白質(zhì)相互作用分析,基因本體論

5、注釋,單個miRNA信號通路的嚴格預測。
　　結(jié)果:肝癌患者與正常人外周血微泡中共檢出460個miRNAs,其中肝癌組檢出385個miRNAs,對照組檢出456個miRNAs,其中共同表達381個miRNAs,4個miRNAs僅在肝癌組出現(xiàn),75個miRNAs僅在對照組出現(xiàn)。與對照組相比,肝癌組有242個miRNAs明顯差異表達。其中115個miRNAs表達顯著增高,倍數(shù)變化值最高31(hsa-miR-671-5p),127個mi

6、RNAs表達顯著降低,倍數(shù)變化值最低0.041(hsa-miR-432)。對表達上調(diào)和下調(diào)的前10名miRNAs分別進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn),NOL3和SRRM1分別在上調(diào)組300個靶基因和下調(diào)組219個靶基因的編碼蛋白質(zhì)的相互作用中具有相對核心地位。信號通路注釋顯示下調(diào)組hsa-miR-323-3p,hsa-miR-381和hsa-miR-495顯著參與了腫瘤,細胞粘附和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)通路,如MAPK信號通路,Wnt信號通路,慢性髓系白血

7、病信號通路,細胞粘附分子信號通路,抗原加工和呈遞信號通路。
　　結(jié)論:肝癌患者外周血來源微泡中miRNA的表達與正常對照明顯不同,miRNA的種類減少以及表達水平下降。肝癌患者外周血來源微泡中異常表達的miRNAs可能通過微泡介導的細胞間信息交流作用參與了肝癌進展。
　　第三部分肝病患者與正常人外周血來源微泡中microRNA表達譜的比較與分析
　　目的:通過比較慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化及肝癌患者外周血微泡(micr

8、ovesicles,MVs)中微小RNA(microRNA,miRNA)表達譜,開發(fā)臨床非侵入性監(jiān)測及預后判斷的生物學標志并探討微泡中miRNAs在慢性乙型病毒性肝炎-肝硬化-肝癌這一疾病轉(zhuǎn)歸過程中的作用。
　　方法:收集正常健康人及慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化及肝癌患者外周血的血漿并分離微泡。提取各組微泡中總RNA并行質(zhì)檢后進行miRNA微陣列芯片雜交,洗片,掃描,信號數(shù)字轉(zhuǎn)化及數(shù)據(jù)標準化統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:與正常人相比,

9、慢性乙型病毒性肝炎,肝硬化及肝癌患者外周血來源微泡中miRNA的表達譜有明顯不同。肝炎組共有378個miRNAs異常表達,其中156個miRNAs表達上調(diào),222個miRNAs表達下調(diào);肝硬化組共有121個miRNAs異常表達,其中64個miRNAs表達上調(diào),57個miRNAs表達下調(diào);肝癌組共242個miRNAs表達異常,其中115個miRNAs表達上調(diào),127個miRNAs表達下調(diào)。進一步比較發(fā)現(xiàn),46個miRNAs在肝炎、肝硬化及