CCL7-CCR3通路在非小細(xì)胞肺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　肺癌目前是發(fā)病率第二高的惡性腫瘤，并且在男性和女性中其致死率目前都居第二位。截止到2014年，美國肺癌的患病人數(shù)已高達(dá)430，090人，且以每年224210人的速度在增長。我國近年來隨著人口的老齡化和環(huán)境污染的加重，肺癌的發(fā)病率也開始成倍增加，每年約有40萬人被確診患有肺癌，發(fā)病率高達(dá)61.4/10萬，成為世界上肺癌患者最多的國家。盡管診斷、手術(shù)和放化療技術(shù)在過去的十年里都得到了很大的提高，肺癌的轉(zhuǎn)移和死亡率

2、仍居高不下，其5年生存率僅有約15％。肺癌根據(jù)細(xì)胞來源的不同可分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC約占全部肺癌的87％。NSCLC又分為腺癌、鱗癌和大細(xì)胞肺癌，其中腺癌是最常見的肺癌類型。目前，大部分患者在發(fā)現(xiàn)肺癌時(shí)已進(jìn)入腫瘤的中晚期，甚至喪失手術(shù)機(jī)會，而即使在早期發(fā)現(xiàn)肺癌并行手術(shù)切除，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率也

3、高達(dá)約1/3。
　　腫瘤的轉(zhuǎn)移是腫瘤導(dǎo)致死亡的重要原因。肺癌最常發(fā)生的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位包括神經(jīng)系統(tǒng)、骨、肝、呼吸系統(tǒng)和腎上腺等，其中骨是肺腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位，39％的肺腺癌患者會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。肺癌的骨轉(zhuǎn)移主要表現(xiàn)為融骨性骨質(zhì)破壞，導(dǎo)致骨折、嚴(yán)重骨痛等，甚至導(dǎo)致癱瘓，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量和預(yù)后，我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)NSCLC骨轉(zhuǎn)移患者3年生存率不足30％。腫瘤的骨轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，目前認(rèn)為肺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制主要有以下幾個(gè)步驟:腫瘤

4、細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)并從原發(fā)灶脫落入血、腫瘤細(xì)胞隨血液移動到骨組織、腫瘤細(xì)胞通過與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的相互作用促發(fā)融骨性破壞和腫瘤增殖，最終形成骨轉(zhuǎn)移灶。
　　趨化因子配體(chemokine ligands)是一類小于100個(gè)氨基酸的小分子化學(xué)趨化因子，在腫瘤的生物學(xué)特性及腫瘤免疫方面發(fā)揮重要作用。根據(jù)其開始兩個(gè)半胱氨酸殘基的不同可分為CC、CX

5、C和XC三類。CCL7是CC趨化因子家族的一員，已被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、腎癌、胃癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中高表達(dá)，并可促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移和侵襲等。同時(shí)，CCL7在免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮重要作用，可調(diào)控單核細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞。然而，CCL7在肺癌中的作用和機(jī)制仍不清楚。
　　研究方法:
　　首先，我們選取在長征醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的NSCLC患者原發(fā)灶樣本和瘤旁肺組織樣本各93例和NSCLC骨轉(zhuǎn)移灶樣本49例，通過表

6、達(dá)譜芯片檢測NSCLC原發(fā)灶和骨轉(zhuǎn)移灶間的基因表達(dá)差異，并通過qRT-PCR和IHC染色檢測了CCL7在瘤旁肺組織、NSCLC原發(fā)灶、NSCLC骨轉(zhuǎn)移灶間的表達(dá)差異，通過統(tǒng)計(jì)IHC染色結(jié)果CCL7表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后的相關(guān)性。
　　然后，我們用CCL7刺激NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和PC9，并檢測了CCL7對NSCLC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、EMT及誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的作用。
　　CCL7的受體主要包括CCR1、CCR2和

7、CCR3，我們進(jìn)一步通過qRT-PCR和IHC染色檢測了CCR1、CCR2和CCR3在NSCLC原發(fā)灶和骨轉(zhuǎn)移灶間的表達(dá)差異，并通過CCR2抑制劑和CCR3抑制劑檢測了抑制CCR2和CCR3對CCL7在NSCLC細(xì)胞中作用的影響，進(jìn)一步通過慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建了CCR3抑制的A549-shCCR3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并通過裸鼠左心室荷瘤檢測了體內(nèi)抑制CCR3對A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶形成能力的影響。
　　最后，我們通過數(shù)字基因表達(dá)譜測序檢測了CCL7

8、刺激A549細(xì)胞后基因表達(dá)的變化，通過GO分析和KEGG分析探索可能的下游通路，并通過qRT-PCR驗(yàn)證了CCL7/CCR3通路對下游基因表達(dá)的調(diào)控作用。
　　研究結(jié)果:
　　我們發(fā)現(xiàn)CCL7在NSCLC骨轉(zhuǎn)移灶中相對NSCLC原發(fā)灶顯著高表達(dá)，并且CCL7高表達(dá)的NSCLC患者臨床預(yù)后較NSCLC低表達(dá)的患者明顯更差。通過CCL7因子刺激A549和PC9細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)CCL7可促進(jìn)A549和PC9細(xì)胞的遷移和侵襲能力，但對細(xì)

9、胞增殖無明顯作用，且通過western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CCL7可促進(jìn)A549和PC9細(xì)胞的EMT。通過CCL7因子刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞(bone marrowmacrophage，BMM)細(xì)胞后，我們發(fā)現(xiàn)CCL7不能直接促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，但來源于CCL7刺激的A549細(xì)胞的條件培養(yǎng)基相對來源于對照組A549細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能更為明顯的促進(jìn)BMM細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化。
　　同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在CCR1、CCR2和CCR3中，CCR2和

10、CCR3均在NSCLC骨轉(zhuǎn)移灶中相對原發(fā)灶高表達(dá)，并與NSCLC患者的總體預(yù)后和腫瘤進(jìn)展相關(guān)，且CCL7可促進(jìn)CCR3的表達(dá)。通過抑制劑分別抑制CCR2和CCR3后，我們發(fā)現(xiàn)抑制CCR3可抑制CCL7對A549和PC9細(xì)胞遷移、侵襲、EMT及誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用，但抑制CCR2對CCL7在A549和PC9細(xì)胞中的作用無明顯影響。通過慢病毒轉(zhuǎn)移構(gòu)建A549-shCCR3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后，對裸鼠進(jìn)行左心室荷瘤，通過活體成像檢測發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)抑

11、制CCR3可顯著抑制A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶的形成。
　　最后，我們通過數(shù)字基因表達(dá)譜測序和信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CCL7可促進(jìn)多個(gè)與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)的基因表達(dá)，如IL1B、CYP1B1、FLCN等，并可能通過激活Ras通路發(fā)揮作用，并且通過qRT-PCR驗(yàn)證了CCL7在A549和PC9細(xì)胞中對這些下游基因表達(dá)的促進(jìn)作用，并發(fā)現(xiàn)抑制CCR3可部分抑制CCL7對下游基因表達(dá)的調(diào)控作用。
　　結(jié)論:
　　基于以上研究結(jié)果，我們認(rèn)為CCL

12、7可能在NSCLC轉(zhuǎn)移特別是骨轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，CCL7可通過誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的EMT促進(jìn)其遷移和侵襲能力，并可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，且在NSCLC細(xì)胞中，CCL7主要通過激活CCR3發(fā)揮作用，而抑制CCR3可在體內(nèi)明顯抑制NSCLC的轉(zhuǎn)移。且CCL7/CCR3通路可能通過激活Ras信號通路在NSCLC中發(fā)揮作用。這些研究結(jié)果表明CCL7/CCR3通路在NSCLC的骨轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要作用，并可能作為NSCL