Notch信號通路在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究.pdf

1、【研究背景】 肝細(xì)胞癌（HCC，以下簡稱肝癌）是最常見的惡性腫瘤之一。我國肝癌的主要病因為乙型肝炎病毒（HBV）感染，但其發(fā)生發(fā)展的分子機制尚未完全清楚。Notch 信號是一個在進(jìn)化中高度保守的反映細(xì)胞間通訊機制的通路，它調(diào)控細(xì)胞的分化和增殖，在胚胎發(fā)育和細(xì)胞命運的決定中發(fā)揮重要的作用。有研究表明Notch 信號也參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，Notch 受體和配體分子表達(dá)失調(diào)以及Notch 信號的異常激活出現(xiàn)在一系列惡性腫瘤中。目前為止

2、，Notch 信號在肝癌中的作用及機制尚未見報道。 【目的】 1. Notch 受體和配體分子在人原發(fā)性肝癌中的表達(dá)；2. Notch 信號與乙型肝炎病毒X 蛋白（HBx）的關(guān)系；3. Notch 信號對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其機制。 【方法】 1. 采用免疫組織化學(xué)方法檢測Notch 受體和配體分子在人原發(fā)性肝癌組織的表達(dá)，并分析上述分子的表達(dá)與肝癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)以及與HBx 表達(dá)之間的關(guān)系

3、；2. 采用RT-PCR 及Western Blot 方法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型HBx 基因的HepG2 細(xì)胞（HepG2X）中Notch 受體和配體分子的表達(dá)；3. 分別用Ras 及其下游信號分子MEK、PI3K 以及p38 的特異性抑制劑處理HepG2X 細(xì)胞，Western Blot 檢測相關(guān)Notch 分子的表達(dá)；4. 采用共聚焦顯微術(shù)以及免疫共沉淀技術(shù)檢測Notch 分子與HBx 的表達(dá)共定位和蛋白分子相互結(jié)合關(guān)系；5. 用雙熒光

4、素酶報告基因?qū)嶒灆z測HBx 對Notch 信號的激活作用；6. 采用正義基因轉(zhuǎn)染、RNAi 技術(shù)改變肝癌HepG2 和SMMC7721 細(xì)胞中Notch1 的表達(dá)水平，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；7. 用Notch信號的特異性抑制劑處理SMMC7721 以及HepG2X 細(xì)胞，得到整個Notch信號被抑制的細(xì)胞模型；8. 利用MTT 方法對上述轉(zhuǎn)染子及抑制劑處理的細(xì)胞進(jìn)行生長曲線的描繪，用平板克隆形成實驗檢測其單細(xì)胞克隆形成能力，軟瓊脂克隆形成

5、實驗檢測錨定非依賴性生長的能力，裸鼠成瘤實驗檢測上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞在體內(nèi)形成移植瘤的能力；9. 采用PI 染色流式細(xì)胞術(shù)檢測上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞及抑制劑處理細(xì)胞的周期的變化，用Annexin ⅴ/PI 雙染色流式細(xì)胞術(shù)、DAPI 染色、透射電鏡技術(shù)以及TUNEL 染色檢測其凋亡情況；10.用基因芯片技術(shù)篩選Notch 信號相關(guān)的差異表達(dá)基因。 【結(jié)果】 1. Notch1、Notch2、Notch4 及Jagged1 在肝癌中表達(dá)失調(diào)

6、免疫組化結(jié)果顯示Notch1、Notch2、Notch3、Notch4 及其配體Jagged1、Delta4 在人原發(fā)性肝癌組織的腫瘤細(xì)胞中存在強弱不等的表達(dá)，其中Notch1和Notch4 表達(dá)于胞漿和胞核中，Notch1 主要表達(dá)于胞漿，其陽性率為88.7％(47/53)，少數(shù)幾例表達(dá)于胞核，陽性率為9.4％ (5/53)；Notch4 在胞漿和胞核中的表達(dá)情況相當(dāng)，陽性率分別為67.9％ (36/53)和58.5％ (31/53)

7、，其余分子Notch2、Notch3 及Jagged1、Delta4 僅表達(dá)于胞漿，陽性率分別為26.4％(14/53)、52.8％ (28/53)、79.2％ (42/53)和67.9％ (36/53)。與癌旁組織相比，胞漿Notch1、核Notch4 以及Jagged1 在肝癌組織中呈高表達(dá)，Notch2 在肝癌中低表達(dá)，其余分子表達(dá)無明顯變化。與臨床病理學(xué)資料相關(guān)性的統(tǒng)計學(xué)分析顯示Notch2、Notch3、Jagged1 和De

8、lta4 的表達(dá)與患者年齡顯著正相關(guān)，Notch1（胞漿）、Notch2、Notch3、Jagged1 及Delta4 的表達(dá)與腫瘤的分化程度顯著相關(guān)；在HBV 陽性的乙肝相關(guān)肝癌中Notch1（胞漿）、Notch4（胞核）及Jagged1 的表達(dá)與HBx 的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。 2. 肝癌中Notch 信號受HBx 調(diào)節(jié)在組織學(xué)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測了Notch 受體和配體分子在體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與組織中相一致的

9、結(jié)果：上述Notch 受體和配體分子的mRNA 和蛋白在HepG2X 和對照細(xì)胞中均有表達(dá)，在mRNA 水平，HepG2X 中Notch1 和Jagged1 的表達(dá)顯著高于對照細(xì)胞；在蛋白水平HepG2X 中Notch1 的跨膜域（NTM1）、Notch4 的胞內(nèi)域（ICN4）及Jagged1的表達(dá)均顯著高于對照細(xì)胞，其余分子表達(dá)與對照細(xì)胞無明顯差異。用Ras或p38 的特異性抑制劑處理HepG2X 細(xì)胞可導(dǎo)致其Notch1 的表達(dá)下調(diào)

10、，而MEK 和PI3K 的抑制劑處理不能影響Notch1 的表達(dá)，Ras 的抑制劑不能影響Notch4 及Jagged1 的表達(dá)，顯示HBx 通過Ras-p38 通路調(diào)節(jié)Notch1 的表達(dá)。 檢測Notch1、Notch4 和Jagged1 與HBx 的共定位和相互作用情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乙肝相關(guān)肝癌組織以及HepG2X 細(xì)胞胞漿中Notch1 和Jagged1 與HBx 分別存在表達(dá)共定位現(xiàn)象，在HepG2X 細(xì)胞中Notch1

11、 和Jagged1 分別與HBx 存在蛋白分子相互結(jié)合關(guān)系。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示HBx 可以一種劑量依賴的方式直接激活肝癌HepG2 細(xì)胞中Notch 信號。 3. Notch 信號通過加快細(xì)胞周期進(jìn)展、抑制細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性生長和增殖行為對五株肝癌細(xì)胞系中Notch1 表達(dá)水平的檢測發(fā)現(xiàn)其在HepG2 細(xì)胞中表達(dá)較低，在SMMC7721 中水平較高。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Notch1 胞內(nèi)域（ICN1）的真核表達(dá)載體后，H

12、epG2 細(xì)胞的生長增殖能力、單細(xì)胞克隆形成能力、錨定非依賴性生長的能力以及裸鼠體內(nèi)成瘤能力增強，細(xì)胞周期G1-S 期的進(jìn)展加快，細(xì)胞凋亡減少；而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Notch1-siRNA 的SMMC7721 細(xì)胞則出現(xiàn)上述生存能力下降，細(xì)胞周期G1-S 期阻滯，細(xì)胞凋亡顯著增加。用Notch 信號的特異性抑制劑處理Notch 信號活性較強的SMMC7721 和HepG2X 細(xì)胞后，同樣發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的生長增殖能力、單細(xì)胞克隆形成能力、錨定非依賴生長的

13、能力較弱，細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞凋亡顯著增多?；蛐酒夹g(shù)檢測ICN1 引起HepG2 細(xì)胞中差異表達(dá)的分子，結(jié)果顯示ICN1 的異源性表達(dá)可引起HepG2 細(xì)胞中一些影響細(xì)胞生長和遷移的分子表達(dá)失調(diào)。 【結(jié)論】 1. Notch 信號分子在肝癌中的表達(dá)及意義：Notch1、Notch2、Notch4 及Jagged1 在肝癌與癌旁組織中差異表達(dá)，可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展；2. Notch信號與HBx 的關(guān)系：HBx 可調(diào)控N

14、otch1、Notch4 及Jagged1 的表達(dá)和功能并激活Notch 信號；3. Notch 信號對于肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及機制：Notch 信號增強可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長增殖能力，加快細(xì)胞周期進(jìn)展，減少細(xì)胞凋亡，Notch 信號的抑制可減弱肝癌細(xì)胞的生長增殖能力，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這些作用可能與其調(diào)控一些影響細(xì)胞生長增殖的分子有關(guān)。Notch 信號促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展，肝癌中Notch 信號受HBx的調(diào)節(jié)，參與H