梓醇對D-半乳糖衰老小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用研究.pdf

1、梓醇是玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosa Libosch)的主要成分，有保肝瀉下，抗炎止痛，降血糖的功效。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究證實(shí)：在細(xì)胞和動物模型上梓醇具有神經(jīng)保護(hù)活性。然而梓醇是一種環(huán)烯醚萜類化合物，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，分離工藝繁瑣，來源有限，因此對現(xiàn)有工藝進(jìn)行優(yōu)化，對于梓醇的藥理活性研究及產(chǎn)品開發(fā)具有現(xiàn)實(shí)意義。本研究旨在優(yōu)化地黃中梓醇的提取純化工藝，重點(diǎn)探討梓醇在D-半乳糖致衰老小鼠模型中的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制，主要研

2、究內(nèi)容與結(jié)果如下： 首先，將微波輔助提取與大孔吸附樹脂柱層析技術(shù)相結(jié)合，對梓醇工藝進(jìn)行了優(yōu)化。 以高效液相色譜法為檢測手段，考察冷浸、超聲波輔助提取、微波輔助提取、熱回流提取、索氏提取五種方法對梓醇提取率的影響。達(dá)到最大提取率時，微波輔助提取用時最短(4min)，說明微波輔助提取方法在提取效率上優(yōu)于其它方法，綜合評價選用微波輔助提取法進(jìn)行梓醇的提取；考察九種不同極性大孔吸附樹脂對梓醇的吸附性能，結(jié)果表明，D101樹脂對梓

3、醇的吸附量較大(76.1mg/g干樹脂)，且對梓醇的解析率較高(92.1％)。該樹脂對梓醇的吸附等溫線符合Langmuir和Freundlich公式，為單分子層吸附，適于地黃醇提取液中梓醇的純化。利用D101樹脂層析柱，上樣量為5BV的地黃濃縮液(2mg/ml)，以水和不同濃度的乙醇洗脫。收集含梓醇的5％乙醇沈脫液，濃縮干燥后，得到梓醇含量大于50％的褐色粉末，將其進(jìn)行硅膠柱層析，氯仿:甲醇(8:2)梯度洗脫得到梓醇單體，純度達(dá)90％以

4、上，得率為600mg/kg藥材。 其次，建立皮下注射D-半乳糖致衰老小鼠模型，研究梓醇的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制。 (1)利用曠場、跳臺和Morris水迷宮，考察梓醇對D-半乳糖衰老模型小鼠認(rèn)知能力的影響，發(fā)現(xiàn)D-半乳糖致衰老小鼠的自主活動和探究能力，被動學(xué)習(xí)記憶和空間認(rèn)知能力下降，應(yīng)用梓醇治療兩周后，明顯改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。病理切片蘇木素-伊紅(HE)染色發(fā)現(xiàn)D-半乳糖衰老小鼠神經(jīng)元細(xì)胞稀疏，細(xì)胞核固縮；生化方法檢測

5、到大腦皮層和海馬內(nèi)膽堿酯酶(AChE)活力上升，免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)基底前腦乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)表達(dá)量減少，免疫印跡方法發(fā)現(xiàn)腦組織乙酰膽堿M受體(mAChR)表達(dá)量降低。應(yīng)用梓醇后，不僅能夠減輕D-半乳糖所致的小鼠大腦病理損傷，而且通過抑制AChE的活力，提高ChAT和mAChR表達(dá)來保護(hù)乙酰膽堿系統(tǒng)，進(jìn)而維持神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)的含量，改善模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。 (2)梓醇對D-半乳糖衰老模型小鼠體內(nèi)抗氧化能力的

6、研究表明：梓醇能顯著提高大腦皮層、海馬、肝和脾組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSH-ST)活力，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量。提示梓醇對衰老模型小鼠具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制之一是提高機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶活力，減輕脂質(zhì)過氧化程度，保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)小鼠大腦皮層、海馬內(nèi)SOD和GSH-Px活力與小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)第五天逃避潛伏期呈負(fù)相關(guān)，MDA水平與第五

7、天逃避潛伏期呈顯著正相關(guān)，表明梓醇改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力可能與其提高大腦抗氧化能力有關(guān)。 (3)考察梓醇對D-半乳糖衰老模型小鼠大腦能量代謝的影響，發(fā)現(xiàn)梓醇能夠降低模型小鼠大腦皮層和海馬組織乳酸脫氫酶(LDH)活力，提高肌酸激酶(CK)、Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力；梓醇治療組小鼠大腦皮層和海馬線粒體呼吸鏈復(fù)合酶Ⅰ、Ⅱ/Ⅲ、Ⅳ活性明顯高于D-半乳糖衰老模型小鼠，梓醇不僅抑制線粒體活性氧(ROS)的產(chǎn)生

8、和線粒體膜電位(MMP)的降低，而且抑制衰老小鼠皮層和海馬細(xì)胞的凋亡，提高抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制凋亡通路關(guān)鍵蛋白caspase-3的活性。這說明梓醇可通過提高線粒體呼吸鏈復(fù)合酶的活性，抑制線粒體ROS的產(chǎn)生，阻止MMP的喪失，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)及拮抗caspase-3的激活，從而保持線粒體功能的完整性，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡同時上調(diào)能量代謝相關(guān)酶的活力，保護(hù)腦組織能量代謝的平衡來發(fā)揮其抗衰老作用。 總之，