絲裂霉素C對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞TGF-β-smads通路作用的初步探討.pdf

1、增生性瘢痕是皮膚損傷后組織修復(fù)過程中出現(xiàn)的瘢痕組織過度增生性病變,瘢痕增生攣縮影響患者的外觀和功能,導(dǎo)致其生活質(zhì)量下降。其發(fā)病機(jī)制和病因目前尚未完全闡明,仍舊是整形科基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)之一。很多實(shí)驗(yàn)己證明絲裂霉素C(mitomycin C,MMC)應(yīng)用于瘢痕疙瘩治療可收到良好的效果。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)是目前公認(rèn)的與瘢痕疙瘩形成最為密切的細(xì)胞因子,研究表明,S

2、mad家族作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)TGF-β下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,在瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展過程中起到關(guān)鍵作用。但針對(duì)絲裂霉素C經(jīng)由TGF-β/Smad信號(hào)通路作用于瘢痕疙瘩分子機(jī)制的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT法檢測(cè)MMC對(duì)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖活性的影響,用Western blot和RT-PCR方法檢測(cè)MMC作用下瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Smads蛋白和TGF-β1mRNA的表達(dá),探討MMC對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的作用機(jī)制,為治療瘢痕增生提

3、供一定的理論參考依據(jù)。
　　 目的:
　　 觀察MMC對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的作用,探討MMC治療瘢痕增生的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1：應(yīng)用手術(shù)中切取的瘢痕疙瘩組織作為體外原代和傳代培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的組織來源,細(xì)胞培養(yǎng)成功后,取3-6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2：實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù):分為正常對(duì)照組、不同濃度MMC干預(yù)組。MMC干預(yù)組分別用2.5μg/m

4、l、12.5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的MMC處理細(xì)胞。正常對(duì)照組用10％FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞。
　　 3：采用四唑鹽比色(MTT)方法,觀察MMC對(duì)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖活性的影響。
　　 4：采用RT-PCR方法,檢測(cè)MMC對(duì)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)的影響。
　　 5：采用Western blot技術(shù)檢測(cè)MMC作

5、用下,體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Smad2/3、Smad4、Smad7蛋白的表達(dá),觀察MMC對(duì)Smad表達(dá)的影響。
　　 6：數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行,采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1：體外瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
　　 體外瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)成功后,培養(yǎng)細(xì)胞呈梭形,細(xì)胞體積較大,胞質(zhì)向外伸出2-3個(gè)長(zhǎng)短不同的偽

6、足,有一個(gè)較大的卵圓形核,細(xì)胞界限清楚,開始單個(gè)細(xì)胞一般鋪展很開,細(xì)胞間排列疏松,有較大的細(xì)胞間隙,隨后細(xì)胞增多,則細(xì)胞相互平行排列,成群細(xì)胞呈漩渦狀或放射行走。
　　 2：MMC對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖活性的影響
　　 2.5μg/ml、12.5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的絲裂霉素分別干預(yù)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞24h,48h,72h,應(yīng)用MTT法測(cè)定MMC對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。2.

7、5μg/ml～200μg/ml時(shí),2.5μg/ml的MMC即對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,這種抑制作用在200μg/ml時(shí)達(dá)到最大,顯示出明顯的劑量—效應(yīng)依賴關(guān)系。在24h、48h、72h這3個(gè)時(shí)間段內(nèi),隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率呈現(xiàn)上升趨勢(shì),作用48h,72h,與24h相比,有極顯著差異(p＜0.01),作用72h與48h相比,但差異不顯著。
　　 3：不同濃度的MMC對(duì)TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響
　　 3

8、.1：RNA提取后,經(jīng)Bio-mini測(cè)定,A260/A280均為1.8-2.0之間;瓊脂糖凝膠電泳顯示所提RNA完整,降解較少。表明RNA提取成功?？俁NA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后背景清晰,未見電泳條帶,表明無基因組DNA的污染。
　　 3.2：TGF-β1 mRN,A RT-PCR.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳為110bp的條帶,結(jié)果與預(yù)期一致,證明所擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片斷。
　　 3-3：TGF-β1與β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物均顯

9、示為清晰的條帶。計(jì)算每例TGF-β1與β-actin條帶光密度的比值作為TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示,正常對(duì)照組,2.5μg/ml、12.5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的絲裂霉素干預(yù)組的TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.88±0.08,0.80±0.07,0.51±0.05,0.47±0.05,0.36±0.04和0.22±0.02。MMC干預(yù)組TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯

10、低于正常對(duì)照組,從12.5μg/mlMMC開始具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。隨MMC濃度增大,MMC干預(yù)組TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈逐漸降低趨勢(shì)。
　　 4：蛋白免疫印跡檢測(cè)Smad2/3、Smad4、Smad7蛋白的表達(dá)
　　 Western-Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn):正常對(duì)照組及MMC2.5μg/ml～200μg/ml不同濃度組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Smad2/3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.11±0.02,0.10

11、±0.04,0.10±0.02,0.08±0.02,0.06±0.01,0.05±0.02:Smad4蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.34±0.04,0.40±0.03,0.36±0.08,0.33±0.10,0.36±0.03,0.39±0.03;Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.04±0.01,0.06±0.02,0.10±0.03,0.18±0.08,0.21±0.10,0.36±0.17。與正常對(duì)照組相比,12.5μg/mlMMC開始對(duì)

12、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Smad7蛋白的表達(dá)具有明顯增強(qiáng)效應(yīng)(P＜0.05),50μg/ml MMC對(duì)Smad2/3蛋白的表達(dá)開始有減弱效應(yīng)(P＜0.05),而對(duì)Smad4蛋白的表達(dá)無明顯變化。
　　 結(jié)論:
　　 1：2.5-200μg/ml范圍的MMC可有效抑制體外培養(yǎng)的病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖活性,當(dāng)濃度為200μg/ml時(shí)作用尤為明顯。
　　 2： MMC對(duì)TGF-β1mRNA的表達(dá)具有明顯減弱效應(yīng);加入不