氧化苦參堿對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原合成及TGF-β-Smad信號(hào)通路的影響.pdf

1、前言：瘢痕疙瘩是以成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞成分過(guò)度增殖和以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積導(dǎo)致的皮膚纖維化疾病,目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。瘢痕疙瘩可造成機(jī)體外形改變和功能障礙。目前大量研究證實(shí)TGF-β/Smads信號(hào)通路與瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是目前已知的可以誘導(dǎo)多種組織纖維化,與瘢痕疙瘩形成關(guān)系非常密切、最具代表性的一種細(xì)胞因子。Smad蛋白家族作為的TGF-β受體下游信號(hào)蛋白,它將TGF-β受體激活后的

2、信號(hào)從胞漿傳遞到細(xì)胞核內(nèi)作用于相應(yīng)的靶基因調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)的合成。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β,TGF-β)是屬于一組調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的TGF-β超家族,是一類分泌型多肽細(xì)胞因子,在哺乳動(dòng)物中,該家族包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、抑制素(inhibins)、活化素(activins)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、生長(zhǎng)分化因子(GDF)等近30種蛋白。這些生長(zhǎng)因子在調(diào)節(jié)細(xì)胞

3、增殖、分化、細(xì)胞外基質(zhì)形成、細(xì)胞遷移、粘附、胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)和骨的重建等方面發(fā)揮重要作用,其突出表現(xiàn)為促進(jìn)膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的形成,同時(shí)還抑制蛋白酶和基質(zhì)酶的活性,從而促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。TGF-β能夠刺激瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中多數(shù)膠原基因mRNA及其蛋白產(chǎn)物的增加,是目前已知的與膠原代謝、瘢痕形成最為關(guān)系密切的細(xì)胞因子。在TGF-β/Smads通路中Smad2、Smad3和Smad4將TGF-β受體激活后的信號(hào)從胞質(zhì)傳遞到胞核中,調(diào)

4、節(jié)膠原等靶基因的轉(zhuǎn)錄。Smad6、Smad7通過(guò)與Smad2、Smad3競(jìng)爭(zhēng)性相結(jié)合TβRI以及干擾Smad2、Smad3和Smad4的結(jié)合來(lái)抑制TGF-β信號(hào)的傳導(dǎo)。Smad4在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起瓶頸的作用。異常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將導(dǎo)致成纖維細(xì)胞大量增殖及細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積。TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是TGF-β發(fā)揮生物學(xué)作用的主要通路,其分子組成與分子調(diào)節(jié)復(fù)雜,與其它信號(hào)通路存在交互影響,對(duì)瘢痕形成的不同階段均有明顯的作用。阻斷成纖維細(xì)

5、胞內(nèi)異常的TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠達(dá)到防治瘢痕疙瘩的作用。
　　 氧化苦參堿(Oxymatrine)來(lái)源于豆科植物苦參、苦豆子及廣豆根中,是一類含有苦參次堿15酮基本結(jié)構(gòu)的化合物。因其具有多方面的藥理活性而引起了人們廣泛的重視和興趣。近年來(lái),對(duì)苦參的提取物氧化苦參堿、苦參堿等深入研究,發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿、苦參堿有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、心律失常、抗病毒、等多方面的藥理作用,特別是在抗組織纖維化治療方面的

6、作用,受到極大的關(guān)注。目前大量研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿在抗肝臟、腎臟、肺、心臟間質(zhì)纖維化中有很好的療效,主要作用機(jī)制與抑制細(xì)胞因子如TGF-β、LI-1、IL-6、PGDF等的合成與分泌,抑制細(xì)胞活化、增殖,合成、分泌膠原成份有關(guān)。Wu等研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿能通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制肝臟纖維化,其作用機(jī)制為增加Smad7的表達(dá),同時(shí)減少Smad3的表達(dá)。劉濤等發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠限制模型大鼠肺纖維化的發(fā)展,其作用機(jī)制是通過(guò)抑制TGF-

7、β1和CTGF的表達(dá)來(lái)減少Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原合成。目前對(duì)于氧化苦參堿是否通過(guò)干擾TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)的合成,達(dá)到治療瘢痕疙瘩的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道?；谝陨涎芯?我們假設(shè):氧化苦參堿可以通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo),達(dá)到抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)的合成的目的,進(jìn)而達(dá)到治療瘢痕疙瘩的目的。為此,我們?cè)O(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn),觀察氧化苦參堿對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中TGF-β

8、/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響,觀察通路中信號(hào)分子TGF-β1、TGF-βR1、TGF-βR2、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、磷酸化Smad2、磷酸化Smad7及Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)情況,驗(yàn)證假設(shè),探討氧化苦參堿對(duì)瘢痕疙瘩的抑制作用及可能的相關(guān)機(jī)制。為開發(fā)新型、高效、低毒的抗瘢痕藥物提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)采用組

9、織塊法,同時(shí)根據(jù)臨床診斷、術(shù)后病理、細(xì)胞形態(tài)觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)染色等方法對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞。
　　 2、MTI、法測(cè)定氧化苦參堿對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響將氧化苦參堿溶于無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基,根據(jù)條件培養(yǎng)液濃度不同分為5組,分別為:①陰性對(duì)照組(不加藥)②0.125mg/ml③0.250mg/ml④0.5mg/ml⑤1.0mg/ml。分別培養(yǎng)24h,48h,72h后取出培養(yǎng)板,每

10、孔加入20ul的MTT溶液(5mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4h,每孔加入DMSO(二甲基亞砜)200ul,振蕩后在全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定570nm處吸收光度值(0D值)。
　　 3、采用TUNNEL法檢測(cè)氧化苦參堿對(duì)HKFB凋亡的影響常規(guī)制作爬片,用含有氧化苦參堿濃度為0.00mg/ml(陰性對(duì)照)、0.125mg/ml、0.250mg/m1、0.5mg/m1、1.0mg/ml的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24h,48h,72h后固定細(xì)胞,免疫

11、細(xì)胞化學(xué)染色,高倍鏡下觀察,計(jì)算凋亡指數(shù)。
　　 4、Western blot法檢測(cè)氧化苦參堿對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Colα1(Ⅰ)、Colα1(Ⅲ)、TGF-β1,Tβ RI,Tβ RII,Smad3,Smad4和Smad7蛋白及TGF-β1誘導(dǎo)的磷酸化Smad3蛋白合成的影響用含有氧化苦參堿濃度為0.00mg/ml(陰性對(duì)照)、0.125mg/ml、0.250mg/ml、0.5mg/m1、1.0mg/ml的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24h

12、,48h,72h后收集細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白,上樣量為80ug。轉(zhuǎn)印到PVDF膜上后用5％脫脂奶粉封閉,用一抗4℃孵育過(guò)夜,分別用相應(yīng)的二抗37℃孵育,ECL發(fā)光1min,掃描,凝膠成像分析系統(tǒng)成像,測(cè)定條帶的平均積分光密度值。目的蛋白灰度值與對(duì)照內(nèi)參比值為其相對(duì)蛋白定量。
　　 5、RT-PCR檢測(cè)氧化苦參堿對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Colα1(Ⅰ)、Colβ1(Ⅲ)、Smad3 mRNA的表達(dá)用含有氧化苦參堿濃度為0.00mg/m1

13、(陰性對(duì)照)、0.125mg/ml、0.250mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)12h,24h,36h后收集細(xì)胞。用TrizolReagent提取VSMC的總RNA,用RT-PCR試劑盒擴(kuò)增目的片段。PCR產(chǎn)物電泳后,用嗅化乙淀染色,BioImaging Systems系統(tǒng)成像,用NIH image軟件分析產(chǎn)物條帶灰度,目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值作為相對(duì)表達(dá)量。
　　 6、免疫熒光檢測(cè)氧化苦

14、參堿對(duì)磷酸化Smad3核轉(zhuǎn)移的影響分別用含有10mg/ml TGF-β1和(或)含有氧化苦參堿濃度為1.0mg/ml的培養(yǎng)基培養(yǎng),以未加藥物培養(yǎng)基為陰性對(duì)照,48h后收集細(xì)胞。4％冷多聚甲醛固定,0.2％TritonⅩ-100通透,山羊血清室溫下封閉30min。一抗4℃濕盒內(nèi)過(guò)夜,TRITC標(biāo)記的二抗避光室溫孵育2h,立即到熒光顯微鏡下觀察照相。
　　 結(jié)果：
　　 1、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:本

15、實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)的細(xì)胞為人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞。
　　 2、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在0～1mg/ml濃度范圍內(nèi),氧化苦參堿對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯影響(P＞0.05)。
　　 3、TUNNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在0～1mg/ml濃度范圍內(nèi),氧化苦參堿對(duì)HKFB的凋亡沒(méi)有明顯影響(P＞0.05)。
　　 4、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:氧化苦參堿能夠明顯抑制Colα1(Ⅰ)、Colα1(Ⅲ)、Smad3及

16、TGF-β1誘導(dǎo)的磷酸化Smad3的表達(dá),并且這種抑制作用具有明顯的時(shí)間濃度依賴性(P＜0.01)。而氧化苦參堿對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞TGF-β1,TβRI,TβRII,Smad4和Smad7蛋白的合成沒(méi)有明顯影響(P＞0.05)。
　　 5、RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:氧化苦參堿能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Colα1(Ⅰ)、Colα1(Ⅲ)、Smad3 mRNA的表達(dá),并且這種抑制作用具有明顯的時(shí)間濃度依賴性(P＜0.01)。

17、>　　 6、免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:氧化苦參堿能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的磷酸化Smad3的核轉(zhuǎn)移(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.在0mg/ml～1mg/ml濃度范圍內(nèi),氧化苦參堿對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖及凋亡沒(méi)有明顯影響,沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。
　　 2.氧化苦參堿可以抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的合成。
　　 3.在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中,氧化苦參堿可以抑制TGF-β/Smad信