旋毛蟲致人小細胞肺癌H446細胞凋亡的研究.pdf

1、肺癌是目前臨床中最常見的惡性腫瘤之一,在我國大城市其發(fā)病率已占惡性腫瘤之首,且發(fā)病呈上升趨勢。其中小細胞肺癌約占肺癌發(fā)病總數(shù)的20％,惡性程度高,倍增時間短,轉(zhuǎn)移早而廣泛,很多病例確診時已屬晚期,手術(shù)的機會大為減少,所以臨床治療選擇放化療為主。近些年國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),多種抗腫瘤活性物質(zhì)存在于多種生物中,一些寄生蟲也具有明顯的抗腫瘤作用。文獻主要報道的有旋毛蟲[1]、瘧原蟲[2]、棘阿米巴滋養(yǎng)體[3-4]、剛地弓形蟲[5]等。并陸續(xù)報道旋毛

2、蟲能抵抗黑色素瘤、結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、肉瘤、白血病、纖維素瘤、骨髓瘤、乳腺癌等[6-9]。目前小細胞肺癌的化療把順鉑列為標準化療藥物,毒副作用較多且容易繼發(fā)耐藥。因此尋求新的小細胞肺癌治療方法有助于提高小細胞肺癌的防治水平。
　　已有報道,旋毛蟲抗腫瘤活性物質(zhì)多來源于旋毛蟲的不同抗原,根據(jù)旋毛蟲來源部位不同將旋毛蟲分為表面抗原、排泄分泌抗原及蟲體可溶性抗原,且有研究表明,表面抗原、排泄分泌抗原蛋白組分復(fù)雜為主要的抗原[10]。王學

3、林等[11]發(fā)現(xiàn),旋毛蟲蟲體蛋白對多種腫瘤細胞均有抑制作用。旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白是培養(yǎng)旋毛蟲肌幼蟲提取其排泄分泌物而獲得的一種生物活性物質(zhì),為了證實其對小細胞肺癌有抑制作用,我們采用體外培養(yǎng)的方法觀察旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白對H446細胞的作用。
　　目的:
　　研究旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白對H446小細胞肺癌的抑制作用,確認其對H446小細胞肺癌細胞的抗腫瘤活性。進一步觀察旋毛蟲分泌蛋白對H446小細胞肺癌細胞凋亡的影

4、響,探討其與相關(guān)凋亡基因及蛋白的關(guān)系。
　　方法:
　　1.人小細胞肺癌 H446細胞株(由中國醫(yī)科大學鄭華川教授贈送),用含10%的優(yōu)級胎牛血清(TBD)做傳代培養(yǎng)。
　　2.實驗分組:分為對照組和不同濃度旋毛蟲排泄分泌蛋白組。陽性對照組:用不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將順鉑稀釋成(12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml

5、)不同濃度分別培養(yǎng)H446細胞;實驗組,旋毛蟲排泄分泌蛋白組:分別用不含F(xiàn)BS的RPMI-1640培養(yǎng)液將提取的旋毛蟲排泄分泌蛋白配制成的終濃度0.075mg/ml,0.15mg/ml,0.3mg/ml的旋毛蟲排泄分泌蛋白培養(yǎng)液,處理細胞;同時設(shè)立陰性對照組:用含10%FBS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)H446細胞。
　　3.采用四唑鹽比色(MTT)方法,觀察旋毛蟲排泄分泌蛋白及順鉑分別作用于人小細胞肺癌0h、12h、24h、36h、48h、7

6、2h后對增殖活性的影響。
　　4.采用TUNEL法檢測不同處理后細胞凋亡情況,分別給予濃度為0.15mg/ml的旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白處理、濃度為6.4μg/ml的順鉑處理、及不給予任何藥物處理24小時后檢測細胞的凋亡。
　　5.采用熒光免疫細胞化學法觀察旋毛蟲排泄分泌蛋白及順鉑作用于人小細胞肺癌H446細胞c-myc蛋白的表達。
　　6.采用蛋白印跡(Western-blot)技術(shù)檢測人小細胞肺癌 H446細胞c-

7、myc蛋白的表達。
　　7.用反轉(zhuǎn)錄 PCR（RT-PCR)技術(shù)檢測人小細胞肺癌 H446細胞Bcl-2mRNA、fas/faslmRNA的表達。
　　8.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件,對結(jié)果進行單因素方差分析,用LSD-t檢驗行兩兩比較,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.旋毛蟲排泄分泌蛋白及順鉑對小細胞肺癌細胞增殖活性的影響
　　1.10.075mg/ml,0.15m

8、g/ml,0.3mg/ml濃度的旋毛蟲排泄分泌蛋白分別處理0h、12h、24h、36h、48h、72h后,H446細胞的生長受到明顯的抑制,且在一定的時間和濃度范圍內(nèi)呈時間、濃度依賴性,經(jīng)過統(tǒng)計學分析,各組之間差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　1.2不同濃度的順鉑分別與H446細胞共培養(yǎng)0h、12h、24h、36h、48h、72h后,H446細胞的生長受到抑制,且一定時間和濃度范圍內(nèi)與時間濃度正相關(guān),經(jīng)統(tǒng)計學分析,各組之

9、間存在差異且有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　2.經(jīng)TUNEL法檢測凋亡細胞,正常培養(yǎng)組未見到凋亡細胞(圖3),被染成棕黃或者棕褐色的細胞為凋亡細胞,紫染的為活細胞;順鉑作用組可見到凋亡細胞(圖5);旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白作用組可見到大量的凋亡細胞(圖4)。經(jīng)統(tǒng)計軟件分析,3組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白作用組更顯著且有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　3.應(yīng)用熒光免疫細胞化學染色法檢

10、測,在0.3mg/ml濃度的旋毛蟲排泄分泌蛋白作用下,連續(xù)培養(yǎng)48h,經(jīng)免疫細胞化學染色法檢測,人小細胞肺癌可見c-myc陽性表達,陽性染色主要定位于胞漿,陰性對照組細胞漿著色很深,胞漿呈現(xiàn)清晰的綠色。而實驗組細胞漿著色很淺。經(jīng)過統(tǒng)計學分析,各組之間差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　4.應(yīng)用蛋白印跡(Western-blot)技術(shù)檢測,在0.3mg/ml濃度的旋毛蟲排泄分泌蛋白作用下,人小細胞肺癌細胞c-myc的相對表達

11、量為0.566±0.054,陽性對照組在6.4μg/ml濃度的順鉑作用下,人小細胞肺癌c-myc的相對表達量為0.776±0.041、陰性對照組人小細胞肺癌細胞c-myc的相對表達量為1.172±0.026,以陰性對照組的表達量最高。經(jīng)過統(tǒng)計學分析,各組之間差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　5.RT-PCR技術(shù)檢測,在0.3mg/ml濃度的旋毛蟲排泄分泌蛋白作用下,人小細胞肺癌細胞Bcl-2mRNA的相對表達量為0.57

12、5±0.047,陽性對照組在6.4μg/ml濃度的順鉑作用下,人小細胞肺癌Bcl-2mRNA的相對表達量為0.776±0.082,陰性對照組人小細胞肺癌細胞Bcl-2mRNA的相對表達量為0.975±0.069,以陰性對照組的表達量最高。經(jīng)過統(tǒng)計學分析,各組之間差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。人小細胞肺癌H446細胞fas mRNA的相對表達量分別為0.769±0.061、0.817±0.121、0.975±0.115,以空白對照

13、組fas的mRNA的表達水平最高。人小細胞肺癌H446細胞fasl mRNA的相對表達量分別為0.669±0.051、0.787±0.124、0.875±0.125,以空白對照組fasl的mRNA的表達水平最低。經(jīng)統(tǒng)計學單因素方差分析,各組之間差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.旋毛蟲排泄分泌蛋白能抑制人小細胞肺癌H446細胞的增殖,誘導其凋亡。
　　2.旋毛蟲排泄分泌蛋白誘導人小細胞肺癌 H4