多西環(huán)素對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的抗腫瘤作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　 肺癌是臨床發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其死亡率居于各種惡性腫瘤之首，且全世界肺癌發(fā)病率還在以每年0.5％的速度增長(zhǎng)。僅有20％-30％的肺癌患者可以早期得以診斷。盡管肺癌的診斷和治療手段不斷取得新的進(jìn)展，但由于腫瘤轉(zhuǎn)移及多藥耐藥等問(wèn)題，肺癌患者預(yù)后仍不佳，五年生存率僅為8-15％。中國(guó)也已成為世界上第一肺癌大國(guó)。按組織學(xué)類(lèi)型可將肺癌分為兩大類(lèi):小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)的16％，且更具侵襲性，在

2、早期就能擴(kuò)散到其它器官，且往往伴有骨轉(zhuǎn)移。
　　 目前肺癌的綜合治療措施仍是以手術(shù)為主，化療、放療為輔?；熓悄壳爸委熤?、晚期腫瘤的主要手段，缺點(diǎn)是對(duì)瘤體細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用的同時(shí)，對(duì)正常組織細(xì)胞也同樣產(chǎn)生殺傷作用，特別是對(duì)生長(zhǎng)迅速的血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等損害更大。化療嚴(yán)重的副作用對(duì)患者的生活質(zhì)量有很大的影響。由于肺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期，許多病人已喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)，同時(shí)化、放療耐受現(xiàn)象又較嚴(yán)重，預(yù)后很差。因此尋求新的有效的肺癌治療藥物，進(jìn)一步

3、提高臨床療效，已成為厄待解決的臨床難題之一。
　　 多西環(huán)素是四環(huán)素類(lèi)抗生素，其分子式為C22H24N2O8，分子量為444.435。具有抗炎、抗菌、神經(jīng)保護(hù)等廣泛的藥理作用。新近研究報(bào)道其對(duì)于多種腫瘤具有一定的細(xì)胞毒作用，包括舌癌、前列腺癌、直腸癌等。目前多西環(huán)素對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞是否有抑制作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究多西環(huán)素對(duì)小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞系NCI-H446增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，并探討其潛在的作用機(jī)制，以期為

4、深入闡明多西環(huán)素的抗腫瘤機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為多西環(huán)素應(yīng)用于臨床治療肺癌提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 (1)探討多西環(huán)素對(duì)體外人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制。①建立人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞培養(yǎng)體系;多西環(huán)素作用于小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞一定時(shí)間段后，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;②應(yīng)用CCK-8法對(duì)各組細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行檢測(cè)，共設(shè)2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml5個(gè)

5、濃度梯度，并設(shè)24、48、72、96小時(shí)共4個(gè)時(shí)間梯度;選用25μg/ml的5-氟尿嘧啶作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（不加藥），檢測(cè)各組相對(duì)生存率，計(jì)算增殖抑制率③平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物處理后各組的克隆形成率;
　　 (2)探討多西環(huán)素對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞調(diào)亡的影響。①多西環(huán)素作用于H446細(xì)胞后，以Hoechst33258染色后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的變化。②Tunel染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡并計(jì)算凋亡指數(shù)③

6、AnnexinV-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)對(duì)藥物（0、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的多西環(huán)素及陽(yáng)性對(duì)照藥物氟尿嘧啶）作用后H446細(xì)胞的早期調(diào)亡率進(jìn)行檢測(cè)。
　　 (3)探討多西環(huán)素誘導(dǎo)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。以不同濃度的多西環(huán)素作用于H446細(xì)胞后，①采用Western blot法檢測(cè)藥物作用后H446細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、caspase3、survivin表達(dá)水平的變化;②

7、采用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)多西環(huán)素藥物刺激對(duì)細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、caspase3、survivin的mRNA表達(dá)水平的影響。
　　 (4)探討多西環(huán)素是否具有抑制人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞遷移和侵襲的能力。①采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)量遷移距離評(píng)價(jià)多西環(huán)素對(duì)H446細(xì)胞的遷移能力的影響②采用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察多西環(huán)素對(duì)H446細(xì)胞的侵襲能力的影響。
　　 (5)探討多西環(huán)素影響人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞

8、侵襲作用的機(jī)制:①采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9及組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP-2的濃度水平②采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的水平。
　　 (6)統(tǒng)計(jì)方法:結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。隨機(jī)設(shè)計(jì)的多樣本資料進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)多重比較時(shí)，方差齊性時(shí)，選擇LSD法，方差不齊時(shí)選擇

9、近似F檢驗(yàn)Welch法，多重比較方法選擇Dunnett's T3法。P＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)（學(xué)）差異。
　　 結(jié)果:
　　 (1)不同濃度的多西環(huán)素(2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)分別作用H446細(xì)胞不同時(shí)間段后，結(jié)果表明隨著多西環(huán)素濃度和作用時(shí)間的增加，H446細(xì)胞存活率降低(p＜0.05）。多西環(huán)素作用24h、48h、72h、96h的IC50分別為24.10μg/m

10、l、10.98μg/ml、8.20μg/ml、8.03μg/ml。不同濃度的多西環(huán)素作用后，加藥組的克隆形成率明顯低于對(duì)照組。藥物濃度越高，克隆形成率越低。5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml組的克隆形成率分別為（23.43±0.33）％、（11.74±0.64）％及(6.14±0.06)％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。上述結(jié)果表明多西環(huán)素可時(shí)間-濃度依賴(lài)性的抑制人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞

11、的增殖。
　　 (2)利用Hoechst33258染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞的凋亡率變化。結(jié)果:熒光顯微鏡下可見(jiàn)，陰性對(duì)照組H446細(xì)胞核界限清晰，圓形或橢圓形，呈均勻藍(lán)色熒光，染色較淺;不同濃度的多西環(huán)素(5、10、20μg/ml)處理48h后，可見(jiàn)細(xì)胞核染色不均一，胞核固縮、碎裂，染色質(zhì)凝集呈顆粒團(tuán)狀分布;在tunel實(shí)驗(yàn)中，陰性對(duì)照組少見(jiàn)明顯的細(xì)胞核被染成棕褐色。5μg/ml、10μg/

12、ml、20μg/ml的多西環(huán)素作用48h后，與陰性對(duì)照組相比均可見(jiàn)被深染的陽(yáng)性細(xì)胞，低、中、高劑量組的凋亡指數(shù)分別為（33.17±0.45）％、(51.14±0.96)％、（64.13±0.09）％,與陰性對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000);0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的多西環(huán)素作用24 h后，人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的早期凋亡率分別為（1.57％±0.06）％、（

13、1.83％±0.06）％、（3.17％±0.06）％和（3.43％±0.06）％。各加藥組與空白組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001，P=0.000，P=0.000)。上述形態(tài)學(xué)變化及凋亡率結(jié)果均表明多西環(huán)素可濃度依賴(lài)性的誘導(dǎo)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的凋亡。
　　 (3)通過(guò)Western Blot、Real-time PCR法檢測(cè)Bax、Bcl-2、caspase-3、survivin的蛋白和mRNA表達(dá)水平的變化，以探討多西

14、環(huán)素誘導(dǎo)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞凋亡作用的可能的機(jī)制。結(jié)果:多西環(huán)素作用于人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞48小時(shí)后，10μg/ml、20μg/ml多西環(huán)素組H446細(xì)胞中Bcl-2 mRNA的相對(duì)含量明顯降低，相對(duì)含量分別為:0.78±0.02及0.39±0.03，與陰性空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008，P=0.003)。5μg/ml劑量組mRNA的相對(duì)含量為0.89±0.04，與陰性空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P=0.159)。陽(yáng)

15、性對(duì)照藥物氟尿嘧啶中Bcl-2 mRNA的相對(duì)含量為0.35±0.01，與陰性空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);Bax的mRNA的相對(duì)含量明顯升高，5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml多西環(huán)素組Bax的mRNA的相對(duì)含量分別為:1.46±0.01、1.54±0.03、1.69±0.06，與陰性空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，P=0.007，P=0.047)。陽(yáng)性對(duì)照藥物氟尿嘧啶組Bax的mRNA的相對(duì)含量

16、為1.56±0.04，與陰性空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010);Caspase-3 mRNA的相對(duì)含量明顯升高，且有濃度依賴(lài)趨勢(shì)。5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml多西環(huán)素組Caspase-3 mRNA的相對(duì)含量分別為:1.44±0.02、1.77±0.04、1.97±0.12，與陰性空白對(duì)照組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，P=0.035，P=0.019)。陽(yáng)性對(duì)照藥物氟尿嘧啶中Caspase-3mRNA的相對(duì)含量

17、為1.93±0.01，與陰性空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036);survivin mRNA的相對(duì)含量明顯降低，且有濃度依賴(lài)趨勢(shì)。5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml多西環(huán)素組survivin mRNA的相對(duì)含量分別為:0.44±0.01、0.31±0.01、0.12±0.00，與陰性空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。陽(yáng)性對(duì)照藥物氟尿嘧啶組survivinmRNA的相對(duì)含量為0

18、.93±0.02，與陰性空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 Western Blot結(jié)果顯示:多西環(huán)素組組H446細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá)量明顯降低，且有濃度依賴(lài)趨勢(shì)。低、中、高劑量Bcl-2的蛋白相對(duì)含量分別為:0.75±0.00、0.65±0.03、0.61±0.03，與陰性空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，P=0.013，P=0.014)。陽(yáng)性對(duì)照藥物氟尿嘧啶組Bcl-2的蛋白含量為0.62±

19、0.02，與陰性空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003);多西環(huán)素組組H446細(xì)胞中Bax的蛋白含量明顯增高，且有濃度依賴(lài)趨勢(shì)。低、中、高劑量組Bax的蛋白相對(duì)含量分別為:1.19±0.01、1.55±0.07、2.60±0.14，與陰性空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.009，P=0.007)。陽(yáng)性對(duì)照藥物氟尿嘧啶組Bax的蛋白相對(duì)含量為2.11±0.06，與陰性空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003);多西

20、環(huán)素組組H446細(xì)胞中caspase-3的蛋白含量明顯增高，且有濃度依賴(lài)趨勢(shì)。低、中、高劑量組casp嬲e-3的蛋白相對(duì)含量分別為1.35±0.00、1.77±0.03、1.86±0.04，與陰性空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.003，P=0.004)。陽(yáng)性對(duì)照藥物氟尿嘧啶組caspase-3的蛋白相對(duì)含量為1.10±0.03，與陰性空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001);多西環(huán)素組組H446細(xì)胞中surviv

21、in的蛋白含量明顯降低，且有濃度依賴(lài)趨勢(shì)。低、中、高劑量組survivin的蛋白相對(duì)含量分別為0.84±0.01、0.64±0.08、0.24±0.06，與陰性空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.017、P=0.003)。陽(yáng)性對(duì)照藥物氟尿嘧啶survivin的蛋白含量為0.35±0.04，與陰性空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。
　　 (4)侵襲、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最本質(zhì)的特性。本研究采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及t

22、ranswell實(shí)驗(yàn)，觀察多西環(huán)素對(duì)H446細(xì)胞侵襲性和遷移能力的影響，結(jié)果表明，多西環(huán)素具有抑制人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞侵襲能力的作用。5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml多西環(huán)素作用48 h后，H446細(xì)胞的遷移距離由對(duì)照組的0.56±0.00分別縮短至0.43±0.01、0.32±0.01、0.11±0.00，與對(duì)照組結(jié)果比較差異均具顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。陽(yáng)性對(duì)照組（氟尿嘧啶）與

23、對(duì)照組結(jié)果比較結(jié)果也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml多西環(huán)素作用48 h后，穿過(guò)人工基底膜的H446細(xì)胞數(shù)由對(duì)照組的471.33±2.08分別減少至265.33±4.04、194.67±3.51和88.00±3.61;各組與陰性對(duì)照組比均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＜0.01）。
　　 (5)研究多西環(huán)素影響H446細(xì)胞侵襲性和遷移能力的可能的機(jī)制。采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中基質(zhì)金屬

24、蛋白酶MMP-2、MMP-9、組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP-2及水平血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的濃度水平。結(jié)果表明:多西環(huán)素組H446細(xì)胞上清液中MMP-2的含量明顯降低，且有濃度依賴(lài)趨勢(shì)。低、中、高劑量組MMP-2的含量分別為19.19±0.23 ng/ml、16.41±0.14 ng/ml、14.71±0.32 ng/ml，與陰性空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。陽(yáng)性對(duì)照藥物氟尿嘧啶組上

25、清液中MMP-2的含量為15.35±0.51ng/ml，與陰性空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);多西環(huán)素組H446細(xì)胞上清液中MMP-9的含量明顯降低，且有濃度依賴(lài)趨勢(shì)。低、中、高劑量組MMP-9的含量分別為2.81±0.16 ng/ml、2.05±0.14 ng/ml、1.64±0.04 ng/ml，與陰性空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022，P=0.004，P=0.000)。陽(yáng)性對(duì)照藥物氟尿嘧啶組上清液中MMP-9

26、的含量為1.42±0.05 ng/ml，與陰性空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);多西環(huán)素組H446細(xì)胞上清液中TIMP-2的含量明顯增加，且有濃度依賴(lài)趨勢(shì)。低、中、高劑量組TIMP-2的含量分別為0.69±0.06ng/ml、0.99±0.07 ng/ml、1.37±0.02 ng/ml，與陰性空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005，P=0.000，P=0.000)。陽(yáng)性對(duì)照藥物氟尿嘧啶上清液中TIMP-2的含量為1.2

27、1±0.07ng/ml，與陰性空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);多西環(huán)素組H446細(xì)胞上清液中VEGF的含量明顯減少，且有濃度依賴(lài)趨勢(shì)。低、中、高劑量組VEGF的含量分別為286.88±3.14 ng/ml、260.37±3.66 ng/ml、230.93±5.30ng/ml，與陰性空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。陽(yáng)性對(duì)照藥物氟尿嘧啶上清液中VEGF的含量為218.77±10.3

28、0 ng/ml，與陰性空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 結(jié)論
　　 多西環(huán)素對(duì)小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的增殖具有抑制作用;5μg/ml-20μg/ml濃度范圍內(nèi)多西環(huán)素可濃度依賴(lài)性的誘導(dǎo)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞調(diào)亡;多西環(huán)素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用可能與調(diào)節(jié)凋亡基因Bax、Bcl-2、caspase3、survivin有關(guān);多西環(huán)素具有抑制人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞遷移與侵襲的能力;多西環(huán)素可通過(guò)調(diào)節(jié)人小細(xì)胞肺